Komplexrií vyšetřování svalových dystrofií pomocí klinických, bioptických a molekulárně genetických diagnostických metod se v naší zemi dosud provádělo pouze ve velmi omezeném rozsahu. Naše skupina (kliiiiků, patologů a genetiků) vyšetřila od roku 1992 do roku 2000 přibližně 240 pacientů suspektních ze svalové dystrofie. Většina pacientů pochází z jihomoravského a severomoravského regionu. Pacienti byli k vyšetření odesíláni zeiména z kUnik a oddělení neurologie a dětské neurologie, dále z odděleni klinické genetiky a méně často z interních klinik a oddělení. Vyšetřovaní pacienti byli podle závěrečné diagnózy rozděleni do skupin pacientů s dystrofinopatií (DMD a BMD), přenašeček dystrofinopatií, pacientů s kongenitální svalovou dystrofií s deficitem merosinu a pacientů s Emery-Dreifussovou svalovou dystrofií, včetně přenašeček tohoto onemocnění. Někteří členové rodin, v nichž se vyskytla dystrofinopatie, byli následně vyšetřeni metodami segregační analýzy. Pacienti DMD/BMD mohou být pomoci molekulárně genetických metod zachyceni ve vysokém procentu. Metoda vyšetření mRŇA pomocí RT PCR a PTT z biopsie dovoluje detegovat delece, duplikace, ale i bodové mutace dystrofinového genu, a tím má vyšší diagnostický rozsah než vyšetření DNA lymfocytů periferní krve metodou multiplex PCR, které zachytí 65 % všech mutací, prakticky jenom delece. Imunofenotypizace dystrofinu se uplatní zejména v odhalování DMD. Deficit sarkolemové reaktivity v karboxytermmální a střední doméně (Dys 1 a Dys 2) jednoznačně signalizuje defektní dystrofiu. Naproti tomu menší deficity dystrofinu u BMD (a též u přenašeček) nemusejí být v biopsii zachyceny. V těchto případech je nutné doplnit vyšetření imunoblotingem nebo analýzou genotypu. Vyšetřování pacientů s klinicky diagnostikovanou svalovou dystrofií by mělo většinou začít vyšetřením biopsie, z níž je možno odhadnout přítomnost a stupeň strukturálních změn, a aplikací protilátek proti DGC případně odhalit patřičný deficit. Imunohistochemické vyšetření je možné doplnit imunoblotingem a tak navést další molekulárně genetické vyšetření DNA či mRNA. Svalovou biopsii je možno v případě deficitu merosinu a emerinu nahradit méně invazivními metodami, jako kožní biopsií nebo výtěrem z bukální sliznice. Při deficitech proteinů DGC je nutno při interpretaci nálezů respektovat možnost sekundární alterace jiných složek, a tak imunohistochemie sama o sobě nemusí být dostatečně informativní. Identifikace a bližší diagnostické zařazení pacientů s deficitem merosinu, sarkoglykanů, emerinu, kalpainu a dalších je možné díky možnosti použití protilátek, které jsou na trhu. Detekce těchto pacientů v naší zemi teprve čeká na jejich soustavné vyhledávání opřené o aplikaci metod popsaných a diskutovaných v tomto sdělení.

Complex diagnosis of muscular dystrophies including clinical, bioptical and molecular genetic approaches has been provided in a limited extent in this country. Our group of neurologists, pathologists and geneticists has examined approximately 240 patients suspected of having muscular dystrophies, mostly coming from Southern and Northern Moravia. The patients were sent to the examination most often firom departments of neurology and clinical genetics, and less firequently fi:om departments of internal medicine. According to the final diagnosis, the patients were divided into groups: with dystrophinopathies and carriers of dystrophinopathies (DMD/BMD), merosin deficient form of congenital muscular dystrophy, and Emery-Dreifuss muscular dystrophy including the carriers of this disease. Some relatives of patients with dystrophinopathies were also examined using the methods of segregation analysis. High proportion of the DMD/BMD patients can be detected by the methods of molecular genetics. Analysis of mRNA using RT PCR and PTT enables the detection of deletions, dupUcations, and point mutations in dystrophin gene and encompasses a larger diagnostic scope in comparison with examinations of DNA level by the multiplex PCR method from the peripheral blood which enables only deletion detections. Immunophenotyping of the dystrophin protein plays an important role especially using antibodies against carboxyterminal (DYS2) and rod domain (DYSl) of dystrophin. Deficient sarcolemmal expression of DYS2 and DYSl reveales unambiguously a pathological dystrophin. On the other hand, less pronounced deficiencies in dystrophin expression in BMD patients and DMD/BMD carriers may not always be detected in muscle biopsies. In this case, it is necessary to supplement the examination by Western blotting and genotype analysis. The examination of patients with clinically diagnosed muscular dystrophy shoidd start with á muscle biopsy which enables the estimation of presence and degree of structural changes. Application of antibodies against the components of DGC and emerin may reveal a deficiency in expression of these proteins. Immunohistochemical examination completed by Western blotting leads to the subsequent molecular genetic analysis of DNA or mRNA. Secondary deficiencies in expression of other DGC proteins are often revealed in muscle biopsies of dystrophinopathies and this fact must be taken into account in the evaluation of immunohistochemical findings. There is a possibility of replacement of invasive muscle biopsy by skin biopsy or buccal mucosal smears in cases of merosin and emerin deficiencies. Commercially available antibodies against merosin, emerin, calpain and sarcoglycans enable extensive identification and detailed classification of muscular dystrophies. Screening of the patients based on the application of methods described and discussed in this report is the task of the forthcoming period.

2 patologicko anatomický ústav MU FN Brno

Muscular dystrophies detected by immunophenotyping and by analysis of genotype (m-RNA and DNA)

Svalové dystrofie detekované imunofenotypizací a analýzou genotypu (m-RNA a DNA) = Muscular dystrophies detected by immunophenotyping and by analysis of genotype (m-RNA and DNA) /

Muscular dystrophies detected by immunophenotyping and by analysis of genotype (m-RNA and DNA) /

Lit: 21

Souhrn: eng