Studium protein‑proteinových interakcí in vivo se v současné době dostává do popředí zájmu – umožňuje prokázat nebo upřesnit již známé protein‑proteinové interakce a odhalit jejich inhibitory, zachytit konformační změny proteinů, objasnit nebo upřesnit signální kaskády v živé buňce s minimálním ovlivněním jejího buněčného prostředí. Jedním z možných přístupů umožňujících tuto charakteristiku jsou metody využívající rezonančního přenosu energie – fluorescenční (FRET) a jeho pozdější modifikace bio­luminiscenční (BRET). Tyto metody jsou založeny na zviditelnění proteinových interakcí pomocí excitace fluorescenčních proteinů, ať už světelně nebo enzymaticky. Tyto přístupy umožňují nejen lokalizovat proteiny v buňce nebo jejich organelách (případně i v malých živočiších), ale i kvantifikovat intenzitu fluorescenčního nebo luminiscenčního signálu a odhalit pevnost vazby mezi interakčními partnery. V tomto příspěvku je objasněn princip metod FRET a BRET, jejich konkrétní aplikace při studiu protein‑proteinových interakcí a jsou popsány dosavadní poznatky získané s využitím těchto metod a upřesňující ně­kte­ré molekulární a buněčné mechanizmy a signalizace související s nádorovou bio­logií.

Nowadays, in vivo protein‑protein interaction studies have become preferable detecting meth­ods that enable to show or specify (already known) protein interactions and discover their inhibitors. They also facilitate detection of protein conformational changes and discovery or specification of signaling pathways in living cells. One group of in vivo methods enabling these findings is based on fluorescent resonance energy transfer (FRET) and its bio­luminescent modification (BRET). They are based on visualization of protein‑protein interactions via light or enzymatic excitation of fluorescent or bio­luminescent proteins. These methods allow not only protein localization within the cell or its organelles (or small animals) but they also allow us to quantify fluorescent signals and to discover weak or strong interaction partners. In this review, we explain the principles of FRET and BRET, their applications in the characterization of protein‑protein interactions and we describe several findings using these two methods that clarify molecular and cellular mechanisms and signals related to cancer bio­logy. Key words: FRET – BRET – imaging methods – protein‑protein interaction in vivo This work was supported by the Czech Science Foundation projects P206/12/G151 and 13--00956S, by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 20. 1. 2014 Accepted: 31. 3. 2014

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie Masarykův onkologický ústav Brno

Detection of protein‑protein interactions by FRET and BRET methods