Úvod: Zubní dřeň představuje relativně snadno dostupný zdroj mezenchymových kmenových buněk. Kmenové buňky ze zubní dřeně (KBZD) byly poprvé izolovány v roce 2000 a od té doby jsou intenzivně studovány. Cíl: Cílem studie bylo optimalizovat proces izolace KBZD, zejména zkrátit dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. U KBZD izolovaných novým postupem stanovit proliferační aktivitu, fenotyp, viabilitu a ověřit schopnost jejich diferenciace ve zralé buněčné typy – osteoblasty, chondroblasty a adipocyty. Materiály a metodika: Extrahovali jsme celkem pět stálých zubů a izolovali pět buněčných linií, které jsme kultivovali v modifikovaném kultivačním médiu (α-MEM) pro adultní mezenchymové progenitorové buňky, obohaceném o 2 % fetálního bovinního séra, růstové faktory, antibiotika, antimykotika, a doplněném o Insulin-Transferrin-Sodium-Selenium supplement. Pro stanovení viability, počtu a velikosti buněk jsme použili přístroje Vi-Cell analyzer a Z2-Counter. Fenotypová analýza byla provedena pomocí průtokového cytometru Cell Lab Quanta. Pro diferenciaci v chondroblasty, osteoblasty a adipocyty jsme použili komerčně dostupná diferenciační média. Průkaz diferenciace jsme dokazovali imunohistochemicky (osteokalcin a kolagen typu II) a histologickým barvením (modrý Massonův trichrom, barvení dle Kossy a olejová červeň). Výsledky: KBZD jsme kultivovali do 8. pasáže. Buňky dosáhly průměrně 47,8 ± 2,0 populačních zdvojení (angl. population doublings; PD). Průměrný čas potřebný pro zdvojení populace (angl. doubling time; DT), činil 39,2 ± 6,1 hodin. Po celou dobu kultivace byly buňky proliferačně aktivní. Průměrná viabilita v 2. pasáži byla 92,3 ± 1,5 % a v 8. pasáži 92,4 ± 1,4 %. Fenotypovou analýzou jsme prokázali vysokou expresi povrchových antigenů pro mezenchymové kmenové buňky (angl. cluster of differentiation; CD) CD13, CD29, CD44, CD90, pro tzv. „stromal associated“ znaky CD73, CD166, a naopak nízkou či nízce pozitivní expresi znaků CD31, CD34, CD45, typických pro endoteliální a hematopoetickou buněčnou řadu. KBZD se diferencovaly ve zralé buněčné typy, osteoblasty a chondroblasty. I přes proadipogenně silně působící médium buňky nediferencovaly v adipocyty. Závěr: Podařilo se nám optimalizovat izolační protokol pro KBZD tím, že jsme zkrátili dobu, po kterou je zubní dřeň enzymaticky štěpena. KBZD izolované touto metodou prokazovaly po celou dobu kultivace vysoký proliferační a diferenciační potenciál. Nezpozorovali jsme žádné známky spontánní diferenciace či degenerace. Právě pro vysokou proliferační aktivitu, široký diferenciační potenciál a snadnou dostupnost představují KBZD budoucnost v regenerativní medicíně.

Introduction: The dental pulp represents an easily accessible source of adult dental pulp stem cells (DPSCs). They were isolated for the first time in 2000 and since then many researchers have investigated and analysed their biological characteristics. Aim: The purpose of this study was to optimize the isolation protocol for DPSCs, namely to shorten the time of enzymatic digestion of the dental pulp, and to cultivate isolated DPSCs using this new approach, investigate their proliferation, phenotype, cell viability and determine their ability to differentiate into mature cells, chondroblasts, osteoblasts, and adipocytes. Materials and methods: Out of five extracted permanent teeth, we isolated five dental pulp stem cell lineages. They were cultivated in a modified cultivation media (α-MEM) for mesenchymal adult progenitor cells containing 2 % fetal bovine serum (FBS) and supplemented with growth factors, antibiotics, antimycotics and Insulin-Transferrin-Sodium-Selenium supplement (ITS). The cell viability, cell count and other properties were examined using a Vi-Cell analyzer and Z2-Counter. The phenotype analysis was performed using a flow cytometer Cell Lab Quanta. For differentiation in chondroblasts, osteoblasts and adipocytes, we used commercially available differentiation media. The evidence of differentiation was proved by the immunocytochemistry (osteocalcin and collagen type II) and histological staining (blue Masson's trichrome, von Koss stain and oil red). Results: We were able to cultivate DPSCs over 47.8 ± 2.0 population doublings (PD). The average population doubling time (DT) was 39.2 ± 6.1 hours. The average cell viability was 92.3 ± 1.5 % in the second passage and 92.4 ± 1.4 % in the eighth passage. DPSCs showed high positivity for mesenchymal stem cell markers (cluster of differentiation; CD) CD29, CD44, CD90 and for stromal associated markers CD13, CD73, CD166 and negative expression or low positivity for hematopoietic markers CD34, CD45 and for CD31. DPSCs differentiated into osteoblasts and chondroblasts. Even after the exposition of the strong adipogenic medium they did not show any signs of differentiation into adipocytes. Conclusion: We have successfully optimized the isolation protocol for DPSCs by shortening the time of enzymatic digestion of the dental pulp. DPSCs isolated using the new method demonstrated the high proliferation and differentiation potential throughout long-term cultivation. We did not observe any signs of spontaneous differentiation or cell degeneration. DPSCs seems to be the promising future for a regenerative and reparative medicine thanks to their remarkable high proliferative potential and ability to differentiate into many mature cell populations.

Stomatologická klinika LF v Hradci Králové UK FN Hradec Králové

Improved isolation protocol for dental pulp stem cells

Literatura