Východiska: Glioblastom (GBM) je nejčastější primární nádor mozku, který je charakterizován nepříznivou prognózou i navzdory veškeré dostupné léčbě. Z tohoto důvodu je vynaloženo mnoho finančních prostředků a úsilí do výzkumu nových prognostických a prediktivních biomarkerů či terapeutických cílů. Dlouhé nekódující RNA (long non-coding – lncRNA) jsou regulátory genové exprese, které hrají významnou roli v patologii GBM, a zdají se proto být vhodnými kandidáty ke studiu. Materiál a metody: Naše studie zahrnovala 14 pacientů s GBM a 8 pacientů s intraktabilní epilepsií, kterým byla odebrána mozková tkáň v rámci epileptochirurgických výkonů. Ribozomální RNA depletovaná RNA byla použita na sekvenování pomocí přístroje NextSeq 500 (Illumina). Statistickou analýzou bylo vyhodnoceno 24 087 mRNA a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým RPKM (počet readů na kilobázi na milión mapovaných readů) alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC Genomic Workbench. Cílené utlumení zvýšené exprese ZFAS1 bylo provedeno pomocí tranzientní transfekce specifické skupiny dvouvláknových RNA (small interfering – siRNA) do stabilních GBM linií (A172, U87MG, T98G). Úspěšnost transfekce byla ověřena prostřednictvím kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce a vliv na viabilitu pomocí MTT assay. Výsledky: Statistickou analýzou bylo objeveno 274 (p < 0,01) lncRNA dysregulovaných ve tkáňových vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Sekvenování taktéž odhalilo 489 dysregulovaných mRNA (p < 0,001) a 26 mRNA (p < 0,000001). Transfekce inhibitoru ZFAS1, jedné z identifikovaných lncRNA, vedla k úspěšnému utlumení hladiny ZFAS1, které ovšem nemělo vliv na snížení míry proliferace buněčných linií. Závěr: Popsali jsme významnou dysregulaci lncRNA a mRNA ve tkáních GBM v porovnání s nenádorovou tkání. Dále jsme úspěšně utlumili hladinu ZFAS1, což ovšem nemělo vliv na proliferaci glioblastomových buněk.

Background: Glioblastoma (GBM) is the most frequent primary brain tumor characterized by an unfavourable prognosis despite multimodal therapy. Therefore, a lot of efforts and financial resources are dedicated to the research of new therapeutic targets and prognostic or predictive biomarkers. Long non-coding RNAs (lncRNAs) are regulators of gene expression which play a significant role in GBM pathology and, thus, present promising candidates. Material and Methods: Our study included 14 patients with GBM and 8 patients with intractable epilepsy from whom we acquired brain tissues during surgical intervention. Ribosomal RNA depleted RNA was used for sequencing by NextSeq 500 instrument (Illumina). Statistical analysis evaluated 24,087 protein-coding and 8,414 non-coding RNAs and their sequential variants with non-zero reads per kilobase per million mapped reads (RPKM) at least in one sample. CLC Genomic Workbench was used for the alignment and target counts. Targeted downregulation of up-regulated ZFAS1, one of the identified lncRNA, level has been carried out by the transient transfection of specific small interfering RNA (siRNA) in GBM stable cell lines (A172, U87MG, T98G). The success of transfection and viability were analyzed in vitro using quantitative real time polymerase chain reaction and MTT assay, resp. Results: Statistical analysis has revealed 274 (p < 0.01) dysregulated lncRNAs in GBMs in comparison with non-tumor brain tissues. Moreover, the results have showed 489 dysregulated mRNAs (p < 0.0001) and 26 mRNAs (p < 0.000001). Transfection of ZFAS1 inhibitor led to successful downregulation of ZFAS1 expression level, although it did not have a significant effect on proliferation of GBM cells. Conclusion: We described a significant dysregulation of lncRNAs and mRNAs in GBM tissue in comparison with non-tumor tissue. We also succesfully decreased expression level of ZFAS1, which in turn, however, had no impact on the viability of GBM cell lines.

1 patologicko anatomický ústav LF MU a FN u sv Anny v Brně

CEITEC Středoevropský technologický institut MU Brno

Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno

Neurochirurgická klinika LF UO a FN Ostrava

Ústav patologie LF MU a FN Brno

Dysregulation of long non-coding RNAs in glioblastoma multiforme and their study through use of modern molecular-genetic approaches