Úvod: Cirkulující volná DNA, tzv. cell-free (cfDNA), jsou degradované fragmenty DNA, vyskytující se v poměrně nízké koncentraci v různých tělních tekutinách. Původ cirkulující cfDNA zůstává nejasný, v plazmě byla původně detekována při nekróze a apoptóze buněk. U jedince po transplantaci (Tx) orgánu existují v cirkulaci dvě odlišné sady DNA, a to DNA dárce a příjemce. Pokud dojde k poškození nebo buněčné smrti transplantované tkáně, dochází k uvolnění DNA dárce do cirkulace příjemce, tzv. donor derived cell-free DNA (ddcfDNA). Vyšší hladiny ddcfDNA v plazmě příjemce mohou být využity jako citlivý biomarker stavu transplantovaného orgánu. Technologie digitální kapkové PCR (ddPCR) umožňuje absolutní kvantifikaci cílové sekvence DNA. Cílem studie byla validace ddPCR při časné diagnostice rejekce štěpu. Metodika: Do studie byly vybrány vzorky pacientů, u kterých byla endomyokardiální biopsií (EMB) potvrzena rejekce srdečního štěpu. Celkově bylo analyzováno 182 párových vzorků DNA izolované z aortální tkáně (dárce/příjemce) odebrané při transplantaci (Tx). Pomocí Fluidigm mikrofluidních čipů byl proveden screening 48 SNPs variant (MAF > 0,5) pro rozlišení genotypu příjemce vs dárce. Pacientům byly během EMB odebírány vzorky krve dle časového harmonogramu: 10. den, 1. měsíc, 3. měsíc, 6. měsíc a 12. měsíc po Tx. Vzorek krve byl zpracován do 30 min po odběru, alikvoty plazmy byly uchovány při - 80 °C před následnou izolací cfDNA. Pomocí ddPCR je stanovena absolutní kvantifikace cfDNA a dle signálu rozlišení cfDNA dárce vs příjemce. Následně je vypočítán percentuální podíl zastoupení cfDNA dárce z celkového množství cfDNA v plazmě jedince. Výsledky: Z analýzy byli vyloučeni všichni heterozygoti (příjemci 48,4 %; dárci 49,1 %). Odlišní homozygoti byli, s výjimkou 6 párů, detekováni ve všech párových vzorcích dárce/příjemce. Odlišní homozygoti byli v páru dárce/příjemce zastoupeni v průměru 5,3 ± 2,5. Pro optimalizaci a validaci metody ddPCR byly vybrány vzorky plazmy (10 D, 1M, 6M a 12M) jedince s EMB prokázanou rejekcí. V pilotním experimentu jsme analyzovali variantu rs521861. FAM-signál zastupuje příjemce, HEX- signál zastupuje dárce. Měřením, a následnou analýzou jsme pomocí ddPCR detekovali nárůst signálu, resp. podílu cfDNA dárce v plazmě pacienta s EMB prokázanou rejekcí štěpu. Shrnutí: Nová, neinvazivní metoda ddPCR využívající plazmu jako tekutou biopsii umožňuje časnou a přesnou diagnózu rejekce Tx-orgánu. Výsledky pilotní studie je třeba ověřit na větším počtu pacientů.

Biotechnologický ústav AV ČR Laboratoř genové exprese Vestec

Centrum experimentální medicíny IKEM Praha

Kardiocentrum IKEM Praha

Katedra antropologie a genetiky člověka PřF UK Praha