Influenza virus, an RNA virus of the Orthomyxoviridae family, is responsible for widespread seasonal epidemics that result in 3 to 5 million severe illnesses and more than half a million deaths annually. Given the persistent circulation of pandemic influenza variants and increasing resistance to available inhibitors, there is an urgent need for new antiviral drugs effective against various viral subtypes. Viral RNA-dependent RNA polymerase, essential for viral replication, has emerged as a promising drug target. The PA subunit with endonuclease function is especially interesting, as development of the highly potent baloxavir marboxil (Xofluza) validated its importance as a novel drug target. Flavonoids have long been studied for their anti-influenza activity but have only recently been recognized as endonuclease inhibitors. We previously identified luteolin and its glucoside derivate, orientin, as potent endonuclease inhibitors, with their binding illustrated by X-ray crystallography structures. Building on this, we employed a scaffold-hopping approach based on the luteolin structure to design structurally distinct compounds that resemble the flavonoid scaffold. Using an AlphaScreen binding assay, we identified 33 as a submicromolar PA inhibitor with low toxicity. We solved the crystal structure of the PA endonuclease-binding pseudoflavonoid 36, which has similar structure and inhibitory potency to 33. Furthermore, we identified 24, 33, 34 and 36 as inhibitors of influenza polymerase in a minireplicon luciferase reporter assay as well as inhibitors of live H1N1 virus infection in A549 human lung cells.

1st Faculty of Medicine Charles University Kateřinská 1660 121 08 Prague 2 Czech Republic

Department of Biochemistry Faculty of Science Charles University Hlavova 8 128 00 Prague 2 Czech Republic

Department of Organic Chemistry Faculty of Science Charles University Hlavova 8 128 00 Prague 2 Czech Republic

Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences Vídeňská 1083 140 00 Prague 4 Czech Republic

Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the Czech Academy of Sciences Flemingovo n 2 166 10 Prague 6 Czech Republic

See more in PubMed

Iuliano A. D. Roguski K. M. Chang H. H. Muscatello D. J. Palekar R. Tempia S. Cohen C. Gran J. M. Schanzer D. Cowling B. J. Wu P. Kyncl J. Ang L. W. Park M. Redlberger-Fritz M. Yu H. J. Espenhain L. Krishnan A. Emukule G. van Asten L. da Silva S. P. Aungkulanon S. Buchholz U. Widdowson M. A. Bresee J. S. Azziz-Baumgartner E. Cheng P. Y. Dawood F. Foppa I. Olsen S. Haber M. Jeffers C. MacIntyre C. R. Newall A. T. Wood J. G. Kundi M. PopowKraupp T. Ahmed M. Rahman M. Marinho F. Proschle C. V. Mallegas N. Feng L. Z. Sa L. Barbosa-Ramírez J. Sanchez D. M. Gomez L. A. Vargas X. B. Herrera B. A. Llanés M. J. Fischer T. K. Krause T. G. Molbak K. Nielsen J. Trebbien R. Bruno A. Ojeda J. Ramos H. an der Heiden M. Signor L. D. C. Serrano C. E. Bhardwaj R. Chadha M. Narayan V. Kosen S. Bromberg M. Glatman-Freedman A. Kaufman Z. Arima Y. Oishi K. Chaves S. Nyawanda B. Al-Jarallah R. A. Kuri-Morales P. A. Matus C. R. Corona M. E. J. Burmaa A. Darmaa O. Obtel M. Cherkaoui I. van den Wijngaard C. C. van der Hoek W. Baker M. Bandaranayake D. Bissielo A. Huang S. Lopez L. Newbern C. Flem E. Groneng G. M. Hauge S. de Cosío F. G. de Moltó Y. Castillo L. M. Cabello M. A. von Horoch M. Osis J. M. Machado A. Nunes B. Rodrigues A. P. Rodrigues E. Calomfirescu C. Lupulescu E. Popescu R. Popovici O. Bogdanovic D. Kostic M. Lazarevic K. Milosevic Z. Tiodorovic B. Chen M. Cutter J. Lee V. Lin R. Ma S. Cohen A. L. Treurnicht F. Kim W. J. Sanz C. D. Ontañón S. D. Larrauri A. León I. Vallejo F. Born R. Junker C. Koch D. Chuang J. H. Huang W. T. Kuo H. W. Tsai Y. C. Bundhamcharoen K. Chittaganpitch M. Green H. K. Pebody R. Goñi N. Chiparelli H. Brammer L. Mustaquim D. Lancet. 2018;391:1285–1300. doi: 10.1016/S0140-6736(17)33293-2. PubMed DOI PMC

te Velthuis A. J. W. Fodor E. Nat. Rev. Microbiol. 2016;14:479–493. doi: 10.1038/nrmicro.2016.87. PubMed DOI PMC

Zhang J. T. Hu Y. M. Musharrafieh R. Yin H. Wang J. Curr. Med. Chem. 2019;26:2243–2263. doi: 10.2174/0929867325666180706112940. PubMed DOI PMC

Zhou Z. X. Liu T. Zhang J. Zhan P. Liu X. Y. Drug Discovery Today. 2018;23:503–518. doi: 10.1016/j.drudis.2018.01.028. PubMed DOI

Stubbs T. M. te Velthuis A. J. W. Future Virol. 2014;9:863–876. doi: 10.2217/fvl.14.66. PubMed DOI PMC

Boivin S. Cusack S. Ruigrok R. W. H. Hart D. J. J. Biol. Chem. 2010;285:28411–28417. doi: 10.1074/jbc.R110.117531. PubMed DOI PMC

Mifsud E. J. Hayden F. G. Hurt A. C. Antiviral Res. 2019;169:104545. doi: 10.1016/j.antiviral.2019.104545. PubMed DOI

Chen S. N. Jiang Z. M. Li Q. C. Pan W. L. Chen Y. Liu J. H. J. Med. Virol. 2024;96:e29622. doi: 10.1002/jmv.29622. PubMed DOI

Hara K. Schmidt F. I. Crow M. Brownlee G. G. J. Virol. 2006;80:7789–7798. doi: 10.1128/JVI.00600-06. PubMed DOI PMC

Dias A. Bouvier D. Crépin T. McCarthy A. A. Hart D. J. Baudin F. Cusack S. Ruigrok R. W. H. Nature. 2009;458:914–918. doi: 10.1038/nature07745. PubMed DOI

Ju H. Zhang J. Huang B. S. Kang D. W. Huang B. Liu X. Y. Zhan P. J. Med. Chem. 2017;60:3533–3551. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01227. PubMed DOI

Ren Y. Wan L. Cao S. Mol. Diversity. 2024;28:1323–1333. doi: 10.1007/s11030-023-10659-x. PubMed DOI PMC

Baughman B. M. Slavish P. J. DuBois R. M. Boyd V. A. White S. W. Webb T. R. ACS Chem. Biol. 2012;7:526–534. doi: 10.1021/cb200439z. PubMed DOI PMC

Chen A. Y. Adamek R. N. Dick B. L. Credille C. V. Morrison C. N. Cohen S. M. Chem. Rev. 2019;119:1323–1455. doi: 10.1021/acs.chemrev.8b00201. PubMed DOI PMC

Crépin T. Dias A. Palencia A. Swale C. Cusack S. Ruigrok R. W. H. J. Virol. 2010;84:9096–9104. doi: 10.1128/JVI.00995-10. PubMed DOI PMC

Cohen S. M. Acc. Chem. Res. 2017;50:2007–2016. doi: 10.1021/acs.accounts.7b00242. PubMed DOI PMC

Credille C. V. Dick B. L. Morrison C. N. Stokes R. W. Adamek R. N. Wu N. C. Wilson I. A. Cohen S. M. J. Med. Chem. 2018;61:10206–10217. doi: 10.1021/acs.jmedchem.8b01363. PubMed DOI PMC

Credille C. V. Chen Y. Cohen S. M. J. Med. Chem. 2016;59:6444–6454. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b00628. PubMed DOI PMC

Noshi T. Kitano M. Taniguchi K. Yamamoto A. Omoto S. Baba K. Hashimoto T. Ishida K. Kushima Y. Hattori K. Kawai M. Yoshida R. Kobayashi M. Yoshinaga T. Sato A. Okamatsu M. Sakoda Y. Kida H. Shishido T. Naito A. Antiviral Res. 2018;160:109–117. doi: 10.1016/j.antiviral.2018.10.008. PubMed DOI

Heo Y. A. Drugs. 2018;78:693–697. doi: 10.1007/s40265-018-0899-1. PubMed DOI

Uehara T. Hayden F. G. Kawaguchi K. Omoto S. Hurt A. C. De Jong M. D. Hirotsu N. Sugaya N. Lee N. Baba K. Shishido T. Tsuchiya K. Portsmouth S. Kida H. J. Infect. Dis. 2020;221:346–355. PubMed

Imai M. Yamashita M. Sakai-Tagawa Y. Iwatsuki-Horimoto K. Kiso M. Murakami J. Yasuhara A. Takada K. Ito M. Nakajima N. Takahashi K. Lopes T. J. S. Dutta J. Khan Z. Kriti D. van Bakel H. Tokita A. Hagiwara H. Izumida N. Kuroki H. Nishino T. Wada N. Koga M. Adachi E. Jubishi D. Hasegawa H. Kawaoka Y. Nat. Microbiol. 2020;5:27–33. doi: 10.1038/s41564-019-0609-0. PubMed DOI

Checkmahomed L. M'hamdi Z. Carbonneau J. Venable M. C. Baz M. Abed Y. Boivin G. J. Infect. Dis. 2020;221:63–70. doi: 10.1093/infdis/jiz418. PubMed DOI PMC

Tomassini J. Selnick H. Davies M. E. Armstrong M. E. Baldwin J. Bourgeois M. Hastings J. Hazuda D. Lewis J. Mcclements W. Ponticello G. Radzilowski E. Smith G. Tebben A. Wolfe A. Antimicrob. Agents Chemother. 1994;38:2827–2837. doi: 10.1128/AAC.38.12.2827. PubMed DOI PMC

Ruan J. A. Lu K. Y. He J. F. Chen Y. H. Li B. X. Wan X. Chen X. Li S. M. Liu S. W. Song G. P. Bioorg. Chem. 2024;144:107139. doi: 10.1016/j.bioorg.2024.107139. PubMed DOI

Liao Y. X. Ye Y. L. Li S. M. Zhuang Y. L. Chen L. Y. Chen J. X. Cui Z. N. Huo L. J. Liu S. W. Song G. P. Eur. J. Med. Chem. 2020;189:112048. doi: 10.1016/j.ejmech.2020.112048. PubMed DOI

Bauman J. D. Patel D. Baker S. F. Vijayan R. S. K. Xiang A. Parhi A. K. Martínez-Sobrido L. LaVoie E. J. Das K. Arnold E. ACS Chem. Biol. 2013;8:2501–2508. doi: 10.1021/cb400400j. PubMed DOI PMC

Credille C. V. Morrison C. N. Stokes R. W. Dick B. L. Feng Y. F. Sun J. X. Chen Y. Cohen S. M. J. Med. Chem. 2019;62:9438–9449. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b00747. PubMed DOI

Miyagawa M. Akiyama T. Taoda Y. Takaya K. Takahashi-Kageyama C. Tomita K. Yasuo K. Hattori K. Shano S. Yoshida R. Shishido T. Yoshinaga T. Sato A. Kawai M. J. Med. Chem. 2019;62:8101–8114. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b00861. PubMed DOI

Sagong H. Y. Parhi A. Bauman J. D. Patel D. Vijayan R. S. K. Das K. Arnod E. LaVoie E. J. ACS Med. Chem. Lett. 2013;4:547–550. doi: 10.1021/ml4001112. PubMed DOI PMC

Sagong H. Y. Bauman J. D. Nogales A. Martínez-Sobrido L. Arnold E. LaVoie E. J. ChemMedChem. 2019;14:1204–1223. doi: 10.1002/cmdc.201900084. PubMed DOI PMC

Zhang L. Ke D. Li Y. T. Zhang H. Zhang X. Wang S. H. Ni S. K. Peng B. Zeng H. X. Hou T. J. Du Y. S. Pan P. C. Yu Y. P. Chen W. T. Eur. J. Med. Chem. 2024;276:116639. doi: 10.1016/j.ejmech.2024.116639. PubMed DOI

Kowalinski E. Zubieta C. Wolkerstorfer A. Szolar O. H. J. Ruigrok R. W. H. Cusack S. PLoS Pathog. 2012;8:e1002831. doi: 10.1371/journal.ppat.1002831. PubMed DOI PMC

Kuzuhara T. Iwai Y. Takahashi H. Hatakeyama D. Echigo N. PLoS Curr. 2009;1:RRN1052. PubMed PMC

Zoidis G. Giannakopoulou E. Stevaert A. Frakolaki E. Myrianthopoulos V. Fytas G. Mavromara P. Mikros E. Bartenschlager R. Vassilaki N. Naesens L. MedChemComm. 2016;7:447–456. doi: 10.1039/C5MD00439J. DOI

Carcelli M. Rogolino D. Bacchi A. Rispoli G. Fisicaro E. Compari C. Sechi M. Stevaert A. Naesens L. Mol. Pharmaceutics. 2014;11:304–316. doi: 10.1021/mp400482a. PubMed DOI

Rogolino D. Naesens L. Bartoli J. Carcelli M. De Luca L. Pelosi G. Stokes R. W. Van Berwaer R. Vittorio S. Stevaert A. Cohen S. M. Bioorg. Chem. 2021;116:105388. doi: 10.1016/j.bioorg.2021.105388. PubMed DOI PMC

Jones J. C. Marathe B. M. Lerner C. Kreis L. Gasser R. Pascua P. N. Q. Najera I. Govorkova E. A. Antimicrob. Agents Chemother. 2016;60:5504–5514. doi: 10.1128/AAC.00888-16. PubMed DOI PMC

Feng J. J. Guo F. Y. Li P. Zhang J. Jiang K. X. Zhu Z. Z. Yin S. S. Lin X. W. Lin F. S. Xiao F. B. Xue X. X. He H. Y. Chen S. H. J. Med. Chem. 2024;67:2570–2583. doi: 10.1021/acs.jmedchem.3c01715. PubMed DOI

Carcelli M. Rogolino D. Gatti A. De Luca L. Sechi M. Kumar G. White S. W. Stevaert A. Naesens L. Sci. Rep. 2016;6:31500. doi: 10.1038/srep31500. PubMed DOI PMC

Král' M. Kotačka T. Reiberger R. Panýrková G. Radilová K. Osifová Z. Flieger M. Konvalinka J. Majer P. Kožíšek M. Machara A. ChemMedChem. 2025;20:e202400577. doi: 10.1002/cmdc.202400577. PubMed DOI

Zima V. Radilová K. Kožíšek M. Albiñana C. B. Karlukova E. Brynda J. Fanfrlík J. Flieger M. Hodek J. Weber J. Majer P. Konvalinka J. Machara A. Eur. J. Med. Chem. 2020;208:112754. doi: 10.1016/j.ejmech.2020.112754. PubMed DOI

Reiberger R. Radilová K. Král' M. Zima V. Majer P. Brynda J. Dračínský M. Konvalinka J. Kožíšek M. Machara A. Int. J. Mol. Sci. 2021;22:7735. doi: 10.3390/ijms22147735. PubMed DOI PMC

Baell J. Walters M. A. Nature. 2014;513:481–483. doi: 10.1038/513481a. PubMed DOI

Baell J. B. J. Nat. Prod. 2016;79:616–628. doi: 10.1021/acs.jnatprod.5b00947. PubMed DOI

Zima V. Radilová K. Kozísek M. Albiñana C. B. Karlukova E. Brynda J. Fanfrlík J. Flieger M. Hodek J. Weber J. Majer P. Konvalinka J. Machara A. Eur. J. Med. Chem. 2020;208:112754. doi: 10.1016/j.ejmech.2020.112754. PubMed DOI

Reiberger R. Radilová K. Král M. Zima V. Majer P. Brynda J. Dracínsky M. Konvalinka J. Kozísek M. Machara A. Int. J. Mol. Sci. 2021;22:7735. doi: 10.3390/ijms22147735. PubMed DOI PMC

Chen L. Cao H. Huang Q. Xiao J. B. Teng H. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2022;62:7730–7742. doi: 10.1080/10408398.2021.1917508. PubMed DOI

Thilakarathna S. H. Rupasinghe H. P. V. Nutrients. 2013;5:3367–3387. doi: 10.3390/nu5093367. PubMed DOI PMC

Del Rio D. Rodriguez-Mateos A. Spencer J. P. E. Tognolini M. Borges G. Crozier A. Antioxid. Redox Signaling. 2013;18:1818–1892. doi: 10.1089/ars.2012.4581. PubMed DOI PMC

La Monica G. Bono A. Alamia F. Lauria A. Martorana A. Bioorg. Med. Chem. 2024;109:117791. doi: 10.1016/j.bmc.2024.117791. PubMed DOI

Kawara K. Tsuji G. Taniguchi Y. Sasaki S. Chem. – Eur. J. 2017;23:1763–1769. doi: 10.1002/chem.201605276. PubMed DOI

Machara A. Hudlicky T. Targets Heterocycl. Syst. 2016;20:113–138.

Fischer J. P., Fell J. B., Blake J. F., Hinklin R. J., Mejia M. J., Hicken E. J., Chicarelli M. J., Gaudino J. J., Vigers G. P. A., Burgess L. E., Marx M. A., Christensen J. G., Lee M. R., Savechenkov P. and Zecca H. J., WO Pat., WO2017201161A1, 2017

Planken S., Cheng H., Collins M. R., Spangler J. E., Brooun A., Maderna A., Palmer C., Linton M. A., Nagata A. and Chen P., US Pat., US2019233440A1, 2020

Suzuki K., Tsurumi Y., Kawano K., Imazeki S. and Murase T., US Pat., US2017342031A1, 2017

Ishiyama T. Takagi J. Ishida K. Miyaura N. Anastasi N. R. Hartwig J. F. J. Am. Chem. Soc. 2002;124:390–391. doi: 10.1021/ja0173019. PubMed DOI

Cameron D. W. Feutrill G. I. Pannan L. J. H. Aust. J. Chem. 1980;33:2531–2541. doi: 10.1071/CH9802531. DOI

Liu C. W. Ji C. L. Hong X. Szostak M. Angew. Chem., Int. Ed. 2018;57:16721–16726. doi: 10.1002/anie.201810145. PubMed DOI

Sagong H. Y. Bauman J. D. Patel D. Das K. Arnold E. LaVoie E. J. J. Med. Chem. 2014;57:8086–8098. doi: 10.1021/jm500958x. PubMed DOI PMC

Yasgar A. Jadhav A. Simeonov A. Coussens N. P. Methods Mol. Biol. 2016;1439:77–98. doi: 10.1007/978-1-4939-3673-1_5. PubMed DOI PMC

Parhi A. K. Xiang A. Bauman J. D. Patel D. Vijayan R. S. K. Das K. Arnold E. LaVoie E. J. Bioorg. Med. Chem. 2013;21:6435–6446. doi: 10.1016/j.bmc.2013.08.053. PubMed DOI

DuBois R. M. Slavish P. J. Baughman B. M. Yun M. K. Bao J. Webby R. J. Webb T. R. White S. W. PLoS Pathog. 2012;8:e1002830. doi: 10.1371/journal.ppat.1002830. PubMed DOI PMC

Mueller U. Förster R. Hellmig M. Huschmann F. U. Kastner A. Malecki P. Pühringer S. Röwer M. Sparta K. Steffien M. Ühlein M. Wilk P. Weiss M. S. Eur. Phys. J. Plus. 2015;130:141. doi: 10.1140/epjp/i2015-15141-2. DOI

Kabsch W. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2010;66:125–132. doi: 10.1107/S0907444909047337. PubMed DOI PMC

Kabsch W. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2010;66:133–144. doi: 10.1107/S0907444909047374. PubMed DOI PMC

Vagin A. Teplyakov A. J. Appl. Crystallogr. 1997;30:1022–1025. doi: 10.1107/S0021889897006766. DOI

Winn M. D. Ballard C. C. Cowtan K. D. Dodson E. J. Emsley P. Evans P. R. Keegan R. M. Krissinel E. B. Leslie A. G. W. McCoy A. McNicholas S. J. Murshudov G. N. Pannu N. S. Potterton E. A. Powell H. R. Read R. J. Vagin A. Wilson K. S. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2011;67:235–242. doi: 10.1107/S0907444910045749. PubMed DOI PMC

Emsley P. Cowtan K. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2004;60:2126–2132. doi: 10.1107/S0907444904019158. PubMed DOI

Chen V. B. Arendall W. B. Headd J. J. Keedy D. A. Immormino R. M. Kapral G. J. Murray L. W. Richardson J. S. Richardson D. C. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2010;66:12–21. doi: 10.1107/S0907444909042073. PubMed DOI PMC