The mechanisms underlying cell protection from cryoinjury are not yet fully understood. Recent biological studies have addressed cryopreserved cell survival but have not correlated the cryoprotection effectiveness with the impact of cryoprotectants on the most important cell structure, the nucleus, and the freeze/thaw process. We identified changes of cell nuclei states caused by different types of cryoprotectants and associate them with alterations of the freeze/thaw process in cells. Namely, we investigated both higher-order chromatin structure and nuclear envelope integrity as possible markers of freezing and thawing processes. Moreover, we analyzed in detail the relationship between nuclear envelope integrity, chromatin condensation, freeze/thaw processes in cells, and cryopreservation efficiency for dimethyl sulfoxide, glycerol, trehalose, and antifreeze protein. Our interdisciplinary study reveals how changes in cell nuclei induced by cryoprotectants affect the ability of cells to withstand freezing and thawing and how nuclei changes correlate with processes during freezing and thawing. Our results contribute to the deeper fundamental understanding of the freezing processes, notably in the cell nucleus, which will expand the applications and lead to the rational design of cryoprotective materials and protocols.
- MeSH
- buněčné jádro * metabolismus MeSH
- buněčné linie MeSH
- kryoprezervace * MeSH
- lidé MeSH
- viabilita buněk MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
Biological effects of high-LET (linear energy transfer) radiation have received increasing attention, particularly in the context of more efficient radiotherapy and space exploration. Efficient cell killing by high-LET radiation depends on the physical ability of accelerated particles to generate complex DNA damage, which is largely mediated by LET. However, the characteristics of DNA damage and repair upon exposure to different particles with similar LET parameters remain unexplored. We employed high-resolution confocal microscopy to examine phosphorylated histone H2AX (gammaH2AX)/p53-binding protein 1 (53BP1) focus streaks at the microscale level, focusing on the complexity, spatiotemporal behaviour and repair of DNA double-strand breaks generated by boron and neon ions accelerated at similar LET values (~135 keV mum
- MeSH
- 53BP1 * chemie MeSH
- apoptóza MeSH
- dvouřetězcové zlomy DNA * MeSH
- fibroblasty účinky záření MeSH
- fluorescenční protilátková technika MeSH
- fosforylace MeSH
- histony * chemie MeSH
- ionizující záření MeSH
- konfokální mikroskopie * MeSH
- kultivované buňky MeSH
- lidé MeSH
- lineární přenos energie * MeSH
- oprava DNA MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
The pathogenesis of myotonic dystrophy type 2 includes the sequestration of MBNL proteins by expanded CCUG transcripts, which leads to an abnormal splicing of their target pre-mRNAs. We have found CCUG(exp) RNA transcripts of the ZNF9 gene associated with the formation of ribonuclear foci in human skeletal muscle and some non-muscle tissues present in muscle biopsies and skin excisions from myotonic dystrophy type 2 patients. Using RNA-FISH and immunofluorescence-FISH methods in combination with a high-resolution confocal microscopy, we demonstrate a different frequency of nuclei containing the CCUG(exp) foci, a different expression pattern of MBNL1 protein and a different sequestration of MBNL1 by CCUG(exp) repeats in skeletal muscle, vascular smooth muscle and endothelia, Schwann cells, adipocytes, and ectodermal derivatives. The level of CCUG(exp) transcription in epidermal and hair sheath cells is lower compared with that in other tissues examined. We suppose that non-muscle tissues of myotonic dystrophy type 2 patients might be affected by a similar molecular mechanism as the skeletal muscle, as suggested by our observation of an aberrant insulin receptor splicing in myotonic dystrophy type 2 adipocytes.
- MeSH
- aktiny metabolismus MeSH
- analýza rozptylu MeSH
- antigeny CD34 metabolismus MeSH
- endotel metabolismus patologie MeSH
- konfokální mikroskopie MeSH
- kosterní svaly metabolismus MeSH
- kůže metabolismus patologie MeSH
- lidé MeSH
- myotonické poruchy diagnóza genetika metabolismus patologie MeSH
- neurofilamentové proteiny metabolismus MeSH
- proteiny S100 metabolismus MeSH
- proteiny vázající RNA genetika metabolismus MeSH
- receptor inzulinu genetika MeSH
- repetitivní sekvence nukleových kyselin genetika MeSH
- RNA metabolismus MeSH
- sestřih RNA genetika MeSH
- transport proteinů fyziologie MeSH
- tukové buňky metabolismus patologie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Histopatologické rysy obou v současnosti definovaných forem myotonické dystrofie (MD1 i MD2) jsou velmi podobné, vykazují charakteristický komplex změn. Vyšetření svalových biopsií in situ může kromě toho přinést i zjištění přítomnosti expanzí repetic CUG resp. CCUG v transkriptu mutované DNA, která tvoří genetický základ onemocnění. Expandované úseky lze znázornit ve tkáňových řezech metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) jako fokální intranukleární inkluze. Pro posouzení významu svalové biopsie v době, kdy je diagnostika MD1 a MD2 založena na DNA analýze lymfocytů z periferní krve, jsme analyzovali výsledky histopatologického vyšetření souboru 34 nemocných, u kterých byla biopsie provedena na základě klinického podezření na myotonickou dystrofii. Diagnóza MD byla potvrzena analýzou DNA pro oba typy onemocnění. FISH byla provedena u 27 z nich. Mutační analýzou DNA byla potvrzena MD1 v 13 případech, MD2 v 10 případech, u 11 pacientů nebyla diagnóza MD1 či MD2 potvrzena. Ve většině případů byl bioptický histopatologický nález u prokázané MD hodnocen buď jako typický pro MD1 či MD2, anebo nález kompatibilní s touto diagnózou. Bioptické nálezy u některých pacientů s MD byly atypické: ve 2 případech byla přítomna zánětlivá infiltrace, v jednom případě obraz připomínající kongenitální myopatii. Naproti tomu histopatologické rysy MD byly zjištěny v některých biopsiích, u nichž diagnóza MD1 ani MD2 nebyla potvrzena. Fokální intranukleární inkluze prokazované FISH byly prokázány u 23 pacientů – ve shodě s výsledky analýzy DNA – u 13 s MD1 a u 10 s MD2. Metodou volby při podezření na myotonickou dystrofii je mutační analýza DNA z periferní krve. V případě provedené svalové biopsie z důvodu atypického klinického obrazu, který nevedl k podezření na MD, však může zhodnocení biopsie vést k dodatečnému molekulárně-genetickému vyšetření pacienta. Metoda FISH v biopsii je zajímavá z teoretického pohledu, neboť umožňuje zkoumat retinovanou RNA v jádrech jednotlivých buněk a tkání postižených pacientů, a tak může napovědět o jejich možné účasti v patogenezi onemocnění.
The histopatological features of both so far defined types of myotonic dystrophy (DM1 and DM2) are very similar, the affected muscles show a typical pattern of changes. The examination of muscle biopsies in situ may also bring about revealing of expansions of CUG or CCUG repetitons in transcripts of the mutated DNA, the genetic basis of the diseases, which may be demonstreated by FISH (fluorescence in situ hybridization) as intranuclear focal accumulation of the transcript. In order to evaluate the importance of muscle biopsy including FISH at the time, when the diagnosis of DM is based on DNA analysis from blood lymphocytes, we analysed the results of histopathological examination of 34 patients, where the biopsy was indicated by clinical suspicion of myotonic dystrophy. The diagnosis was verified by mutation analysis of DNA for both DM1 and DM2. The examination was supplemented by FISH in 27 patients. The diagnosis of DM1 was confirmed in 13 patients, DM2 in 10 patients, the diagnosis of DM1 or DM2 was not confirmed in 11 patients. The biopsy brought about confirmation or precision-specification of the clinical diagnosis or suggested the diagnosis of DM in the majority of the patients. The bioptic findings in some patients with DM were atypical: in two cases there was inflammatory infiltration, in one case a picture resembling congenital myopathy. On the other hand, histopathological features of myotonic dystrophy were present in several biopsies where the diagnosis of DM was not confirmed. Focal accumulation of CUG/CCUG repeats in myonuclei was demonstrated by fluorescence in situ hybridization – in accordance with the DNA examination – in 23 patients, 13 with DM1 and 10 with DM2. Mutation analysis of the DNA isolated from blood leukocytes represent the method of choice if the diagnosis of DM is suspected. On the other hand, muscle biopsy may reveal histopathological features that may indicate subsequent molecular genetic examination of the patient if the results of the clinical examination are equivocal or atypical. FISH in the biopsy may reveal the intranuclear focal accumulation of the RNA transcripts in cells and tissues of the affected patiens and, in this way, to suggest a possible participation of them in the pathogenesis of the disease.
- MeSH
- biopsie metody využití MeSH
- cytogenetické vyšetření využití MeSH
- financování organizované MeSH
- histologie srovnávací metody MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční metody využití MeSH
- interpretace statistických dat MeSH
- lidé MeSH
- mutace genetika MeSH
- myotonická dystrofie diagnóza genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
- MeSH
- buněčné jádro genetika ultrastruktura MeSH
- chromatin genetika ultrastruktura MeSH
- DNA nádorová genetika MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- hybridizace in situ MeSH
- kolorektální nádory genetika patologie MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- lidské chromozomy genetika ultrastruktura MeSH
- senioři MeSH
- Check Tag
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- senioři MeSH
