Leukemias harboring the ETV6-ABL1 fusion represent a rare subset of hematological malignancies with unfavorable outcomes. The constitutively active chimeric Etv6-Abl1 tyrosine kinase can be specifically inhibited by tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Although TKIs represent an important therapeutic tool, so far, the mechanism underlying the potential TKI resistance in ETV6-ABL1-positive malignancies has not been studied in detail. To address this issue, we established a TKI-resistant ETV6-ABL1-positive leukemic cell line through long-term exposure to imatinib. ETV6-ABL1-dependent mechanisms (including fusion gene/protein mutation, amplification, enhanced expression or phosphorylation) and increased TKI efflux were excluded as potential causes of resistance. We showed that TKI effectively inhibited the Etv6-Abl1 kinase activity in resistant cells, and using short hairpin RNA (shRNA)-mediated silencing, we confirmed that the resistant cells became independent from the ETV6-ABL1 oncogene. Through analysis of the genomic and proteomic profiles of resistant cells, we identified an acquired mutation in the GNB1 gene, K89M, as the most likely cause of the resistance. We showed that cells harboring mutated GNB1 were capable of restoring signaling through the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt/mTOR and mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways, whose activation is inhibited by TKI. This alternative GNB1K89M-mediated pro-survival signaling rendered ETV6-ABL1-positive leukemic cells resistant to TKI therapy. The mechanism of TKI resistance is independent of the targeted chimeric kinase and thus is potentially relevant not only to ETV6-ABL1-positive leukemias but also to a wider spectrum of malignancies treated by kinase inhibitors.
- MeSH
- chemorezistence účinky léků MeSH
- fúzní onkogenní proteiny genetika MeSH
- imatinib mesylát aplikace a dávkování MeSH
- inhibitory proteinkinas aplikace a dávkování MeSH
- leukemie farmakoterapie genetika patologie MeSH
- lidé MeSH
- malá interferující RNA genetika MeSH
- mutace MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- proteiny vázající GTP - beta-podjednotky genetika MeSH
- signální transdukce účinky léků MeSH
- tyrosinkinasy genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Affinity purification is a useful approach for purification of recombinant proteins. Eukaryotic expression systems have become more frequently used at the expense of prokaryotic systems since they afford recombinant eukaryotic proteins with post-translational modifications similar or identical to the native ones. Here, we present a one-step affinity purification set-up suitable for the purification of secreted proteins. The set-up is based on the interaction between biotin and mutated streptavidin. Drosophila Schneider 2 cells are chosen as the expression host, and a biotin acceptor peptide is used as an affinity tag. This tag is biotinylated by Escherichia coli biotin-protein ligase in vivo. We determined that localization of the ligase within the ER led to the most effective in vivo biotinylation of the secreted proteins. We optimized a protocol for large-scale expression and purification of AviTEV-tagged recombinant human glutamate carboxypeptidase II (Avi-GCPII) with milligram yields per liter of culture. We also determined the 3D structure of Avi-GCPII by X-ray crystallography and compared the enzymatic characteristics of the protein to those of its non-tagged variant. These experiments confirmed that AviTEV tag does not affect the biophysical properties of its fused partner. Purification approach, developed here, provides not only a sufficient amount of highly homogenous protein but also specifically and effectively biotinylates a target protein and thus enables its subsequent visualization or immobilization.
- MeSH
- antigeny povrchové chemie genetika izolace a purifikace metabolismus MeSH
- biotin chemie metabolismus MeSH
- biotinylace MeSH
- buněčné linie MeSH
- Drosophila cytologie MeSH
- Escherichia coli enzymologie genetika MeSH
- exprese genu MeSH
- glutamátkarboxypeptidasa II chemie genetika izolace a purifikace metabolismus MeSH
- krystalografie rentgenová MeSH
- lidé MeSH
- molekulární modely MeSH
- molekulární sekvence - údaje MeSH
- rekombinantní proteiny chemie genetika izolace a purifikace metabolismus MeSH
- sekvence aminokyselin MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
- Research Support, N.I.H., Intramural MeSH
- Research Support, U.S. Gov't, Non-P.H.S. MeSH
- MeSH
- adenin analogy a deriváty terapeutické užití MeSH
- antitumorózní látky terapeutické užití MeSH
- chemorezistence MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- financování organizované MeSH
- lidé MeSH
- lymfom farmakoterapie genetika MeSH
- potkani Sprague-Dawley MeSH
- proteiny spojené s mnohočetnou rezistencí k lékům genetika metabolismus MeSH
- regulace genové exprese u nádorů MeSH
- transplantace nádorů MeSH
- velikost orgánu MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
Syndrom diabetické nohy s defektem se objeví až u 15-20 % diabetiků v průběhu jejich života. Jedná se o častý, ale mnohdy zanedbávaný problém. Etiologie diabetické ulcerace je spojena zejména s neuropatií a ischémií dolních končetin, na jejímž vzniku se často podílí trauma. Infekce prodlužuje a někdy i znemožňuje hojení diabetické rány, významně zvyšuje riziko amputací. Důsledkem neuropatie je i Charcotova osteoartropatie, která vede často ke vzniku ulcerací. Časnou terapií této nemoci v akutní fázi se dá předejít vzniku deformit a jejich komplikacím. Riziko vzniku syndromu diabetické nohy roste s věkem, komorbiditami, délkou trvání diabetů. Komplexní léčba syndromu diabetické nohy musí zahrnovat řešení všech rizikových faktorů - ischémie, tlaku na ulceraci, infekce, metabolické kompenzace. Lokální léčba znamená debridement (odstranění nekróz), použití lokálních prostředků podporujících granulaci a epitelizaci rány, a pak i ochranu nově vzniklé jizvy před recidivou defektu. Důležitou roli v terapii má chirurgická léčba. Kromě účinného debridementu a preventivních operací má za úkol provést v indikovaných případech nezbytně nutné amputační výkony ve snaze zachovat co nejlépe funkčnost končetiny. Primární prevence vzniku nových ulcerací a sekundární prevence vzniku reulceraci sehrává klíčové postavení při redukci počtu nemocných se syndromem diabetické nohy.
A diabetic foot ulcer appears in 15-20 % of diabetics in their lifetime. It is a very frequent, but often neglected problém. The aetiology of a diabetic ulcer is particularly associated with neuropathy and ischaemia of the lower limb, most often induced by a trauma. Infectious complication prolongs or arrests the healing process, significantly increasing the risk of amputation. Charcot arthropathy very often leads to the foot ulcer, it is one of the consequences of neuropathy. Early diagnosis and treatment of Charcot arthropathy in the acute phase of disease may prevent deformity and its complications. The risk of diabetic foot syndrome increases with age, comorbidities, and duration of diabetes. Complex therapy of diabetic foot syndrome includes treatment of all risk factors such as ischaemia, infection, pressure on ulceration, metabolic compensation. Local therapy implies debridement (necrectomy), using a new local treatment, which encourages granulation and epithelisation, and then protecting the newly created scar against trauma. Surgical treatment represents an important role in the therapy. There are a host of surgical procedures - preventivě operations, effective debridement, and resecting infected bone. The most important is essential amputation in indicated cases. There is a tendency to minimize amputations and protéct the structure and the function of the foot. Primary prevention of diabetic ulcers and secondary prevention of reulceration play key roles in reducing the number of patients with diabetic foot syndrome.
- MeSH
- diabetická noha etiologie komplikace terapie MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- hojení ran fyziologie účinky léků MeSH
- infekce měkkých tkání klasifikace terapie MeSH
- lidé MeSH
- ortopedické výkony klasifikace metody využití MeSH
- resorpce kosti etiologie MeSH
- vředy na noze (od hlezna dolů) etiologie prevence a kontrola terapie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
- Publikační typ
- abstrakt z konference MeSH
