JavaScript NENÍ povolen !

Differentiation between distinct stages is fundamental for the life cycle of intracellular protozoan parasites and for transmission between hosts, requiring stringent spatial and temporal regulation. Here, we apply kinome-wide gene deletion and gene tagging in Leishmania mexicana promastigotes to define protein kinases with life cycle transition roles. Whilst 162 are dispensable, 44 protein kinase genes are refractory to deletion in promastigotes and are likely core genes required for parasite replication. Phenotyping of pooled gene deletion mutants using bar-seq and projection pursuit clustering reveal functional phenotypic groups of protein kinases involved in differentiation from metacyclic promastigote to amastigote, growth and survival in macrophages and mice, colonisation of the sand fly and motility. This unbiased interrogation of protein kinase function in Leishmania allows targeted investigation of organelle-associated signalling pathways required for successful intracellular parasitism.

MeSH
biologické modely MeSH
buněčná diferenciace * MeSH
CRISPR-Cas systémy genetika MeSH
delece genu MeSH
flagella enzymologie MeSH
Leishmania mexicana cytologie enzymologie MeSH
leishmanióza parazitologie patologie MeSH
mutace genetika MeSH
myši inbrední BALB C MeSH
protein Cas9 metabolismus MeSH
proteinkinasy genetika metabolismus MeSH
proteom metabolismus MeSH
Psychodidae parazitologie MeSH
viabilita buněk MeSH
zvířata MeSH
Check Tag
ženské pohlaví MeSH
zvířata MeSH
Publikační typ
časopisecké články MeSH
práce podpořená grantem MeSH

Web zdroj

Nový test pro klasickou a variantní Niemann-Pickovu chorobu typu C. Zjištění patogenity častých alel spojovaných s pozdními formami NPC [Novel test for classical and variant Niemann-Pick type C disease. Evaluation of pathogenicity of frequent NPC1 alleles implicated in late-onset NPC]

Hřebíček, Martin, 1961-
Autor Autorita ORCID
Univerzita Karlova. Lékařská fakulta, 1
Autor Autorita

2020

Závěrečná zpráva o řešení grantu Agentury pro zdravotnický výzkum MZ ČR

Nestr.

Niemann-Pick type C disease (NPC) can present in any age and especially in adulthood it may be misdiagnosed or detected late. The novel diagnostic test for NPC is based on loading of cells with cholesterol-dextran nanoparticles (Chol/Dex) in order to amplify the differences in metabolite levels between NPC controls and patients. Deuterium-labeled cholesterol in Chol/Dex will enable quantification of endocytosed cholesterol by tandem-mass spectrometry. Optimized test will be evaluated in more than 25 skin fibroblast cell lines from patients with different forms of NPC; cholesterol/cholesteryl ester ratio will be calculated. Cell lines homozygous for frequent variants in NPC1 gene implicated in adult forms of NPC will be created by genome editing using CRISPR-Cas9 and evaluated using the Chol/Dex-based test to determine their pathogenicity. The test will be adapted to white blood cells and cultured lymphocytes and its usefulness for diagnostics of NPC will be evaluated.

Niemann-Pickova choroba typu C (NPC) se může projevit poprvé v jakémkoli věku a zejména v dospělosti může být diagnostikována pozdě nebo chybně. Nový kvantitativní diagnostický test pro NPC, který podstatně usnadní diagnostiku nemoci, je založen na zátěži buněk cholesterol-dextranovými nanočásticemi (Chol/Dex) pro zvýraznění rozdílů v koncentracích metabolitů mezi pacienty s NPC a kontrolami. Deuterovaný cholesterol v Chol/Dex dovolí kvantifikaci endocytovaného cholesterolu tandemovou hmotnostní spektrometrií. Optimalizovaný test bude proveden ve více než 25 kulturách kožních fibroblastů pacientů s různými formami NPC a bude vypočítán poměr cholesterol/cholesteryl ester. Technikou CRISPR-Cas9 připravíme buněčné linie homozygotní pro časté varianty v genu NPC1 spojované s dospělou formou nemoci a pomocí testu určíme jejich patogenitu. Test bude upraven pro užití v bílých krvinkách a kultivovaných lymfocytech a bude zhodnoceno jeho možné diagnostické využití.

Konspekt
Patologie. Klinická medicína
NLK Obory
neurologie
genetika, lékařská genetika
NLK Publikační typ
závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Článek

CRISPR-Cas9 jako nástroj v terapii nádorových onemocnění
[CRISPR-Cas9 as a tool in cancer therapy]

Klinická onkologie. 2019 ; 32 (Suppl. 3) : 13-18.

ISSN 0862-495X
Medvik
Zdroj

RECAMO2020...prostřednictvím výzkumu rakoviny k aplikované molekulární onkologii.... 2019 ; () : 13-18.

Medvik
Zdroj

Východiska: Editace genomu využívající CRISPR-Cas9 se v průběhu krátké doby zařadila mezi základní metody bio logického výzkumu. Tento nedávno objevený mechanizmus adaptivní antivirové obrany bakterií se podařilo přizpůsobit potřebám vědy a učinit z něj tak neocenitelný nástroj v manipulaci s DNA. K rozšíření metody přispěla především její jednoduchost a spolehlivost, s jakou ji lze využít. Pod pojmem editace genomu rozumíme úpravy genomové DNA cílené s přesností na jeden pár bází. V jednoduchosti zaměření enzymu na cílovou sekvenci se CRISPR-Cas9 zásadním způsobem liší od předchozích technologií. Na poli výzkumu nádorových onemocnění umožnil CRISPR-Cas9 vývoj řady modelových systémů vhodných pro studium karcinogeneze a testování léčiv. Z terapeutického hlediska našel CRISPR-Cas9 uplatnění v oblasti imunoterapie, a to zejména při ex vivo genetických modifikacích T lymfocytů pa cienta. Cíl: Terapeutický potenciál CRISPR-Cas9 v léčbě nádorových onemocnění se nyní snaží ověřit několik klinických studií. Na základě těchto studií jsme v článku shrnuli strategie použité při přípravě terapeutických nástrojů použitelných v protinádorové terapii. Závěr: Technologie CRISPR-Cas9 se ukazuje jako nepostradatelná v oblasti základního výzkumu při studiu funkce jednotlivých genů v procesu karcinogeneze. Využití metody v protinádorové terapii je více problematické. Před vlastní klinickou praxí je potřeba provést ještě řadu optimalizací týkajících se účinnosti, bezpečnosti a specifity CRISPR-Cas9.

Background: Genome editing using CRISPR-Cas9 has become one of the basic methods of biological research over a short period of time. This recently discovered system of adaptive immunity of bacteria has been adapted to the needs of science and has become a valuable tool for DNA manipulation. Its simplicity and reliability have contributed to widespread use of the method. Genome editing refers to targeted modifications of genomic DNA with single base pair accuracy. CRISPR-Cas9 differs significantly from previous technologies in the simplicity of directing the enzyme to the target sequence. In the field of cancer research, CRISPR-Cas9 has enabled the development of a number of models for the study of carcinogenesis and drug testing. From a therapeutic point of view, CRISPR-Cas9 has been applied in the field of immunotherapy, especially in ex vivo genetic modifications of the T-cells of patients. Aim: Currently, several clinical trials are trying to verify the therapeutic potential of CRISPR-Cas9. Based on these studies, we have summarised the strategies used in the preparation of therapeutic tools useful in cancer therapy. Conclusion: CRISPR-Cas9 appears to be crucial in basic research, particularly in the study of the function of individual genes involved in carcinogenesis. However, it will still be necessary to optimise the efficacy, safety and specificity of CRISPR-Cas9 before it is used in clinical practice.

MeSH
imunoterapie metody MeSH
klinická studie jako téma MeSH
lidé MeSH
nádory * terapie MeSH
protein Cas9 * imunologie terapeutické užití MeSH
Check Tag
lidé MeSH
Publikační typ
práce podpořená grantem MeSH
přehledy MeSH

Web zdroj

Rezistence na léčbu monoklonálními protilátkami u B-CLL a B-lymfomů: příčiny vzniku a potenciální intervenční strategie [Resistance to monoclonal antibody therapy at B-CLL and B-lymphomas: its foundations and potential intervention strategies]

Šmída, Michal
Autor Autorita
Doubek, Michael, 1972-
Autor Autorita
Fakultní nemocnice (Brno, Česko)
Autor Autorita
Masarykova univerzita. Středoevropský technologický institut
Autor Autorita

2019

Závěrečná zpráva o řešení grantu Agentury pro zdravotnický výzkum MZ ČR

Nestr.

Monoclonal antibody (mAb) therapy often encounters resistance due to downmodulation of the target antigens. The exact underlying mechanisms remain unknown as well as the efficacy of newly developed mAbs. We propose to investigate the impact of several clinically advanced mAbs on the expression level of their target antigen and determine functional consequences of lower target expression on the potency of mAbs in cell killing. We will characterize cellular mechanisms regulating the surface expression of antigens that are downregulated in response to any of the mAbs. We shall investigate how are these antigens degraded and explore changes on the transcriptional and translational level, changes in promoter activity and epigenetic alterations. Finally, we will perform rescue screen with inhibitors of epigenetic modifying enzymes and a whole genome loss-of-function screen using novel state-of-the-art technique. This will identify proteins involved in the regulation of surface expression and suggest intervention strategies that may lead to upregulation of the antigens on the cell surface.

Terapie monoklonálními protilátkami (mAbs) se často potýká s rezistencí způsobenou snížením exprese cílových antigenů. Podstata zapříčiňujících mechanismů zůstává neznámá, stejně jako účinnost nově vyvinutých mAbs. V tomto projektu budeme testovat vliv několika klinicky nejvíce pokročilých mAbs na úroveň exprese jejich cílového antigenu a určíme funkční důsledky snížené exprese na efektivitu protilátek v usmrcování buněk. Charakterizujeme buněčné mechanismy regulující povrchovou expresi antigenů, které jsou downregulovány v reakci na některou z mAbs. Prozkoumáme, jakými mechanismy jsou tyto antigeny degradovány a budeme sledovat změny na úrovni transkripce a translace, změny v aktivitě promotoru a epigenetické modifikace. Na závěr provedeme screening s inhibitory epigenetických enzymů a celogenomový “loss-of-function” screening s využitím nové technologie na úrovni dnešní doby. Tento přístup povede k identifikaci proteinů podílejících se na regulaci povrchové exprese a navrhne intervenční strategie, které mohou vést k upregulaci antigenů na buněčném povrchu.

NLK Obory
onkologie
biochemie
genetika, lékařská genetika
NLK Publikační typ
závěrečné zprávy o řešení grantu AZV MZ ČR

Článek

Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation

Genome biology. 2019 ; 20 (1) : 171. [pub] 20190826

Genome Biol
ISSN 1474-760X
Medvik
Zdroj

BACKGROUND: CRISPR-Cas9 gene-editing technology has facilitated the generation of knockout mice, providing an alternative to cumbersome and time-consuming traditional embryonic stem cell-based methods. An earlier study reported up to 16% efficiency in generating conditional knockout (cKO or floxed) alleles by microinjection of 2 single guide RNAs (sgRNA) and 2 single-stranded oligonucleotides as donors (referred herein as "two-donor floxing" method). RESULTS: We re-evaluate the two-donor method from a consortium of 20 laboratories across the world. The dataset constitutes 56 genetic loci, 17,887 zygotes, and 1718 live-born mice, of which only 15 (0.87%) mice contain cKO alleles. We subject the dataset to statistical analyses and a machine learning algorithm, which reveals that none of the factors analyzed was predictive for the success of this method. We test some of the newer methods that use one-donor DNA on 18 loci for which the two-donor approach failed to produce cKO alleles. We find that the one-donor methods are 10- to 20-fold more efficient than the two-donor approach. CONCLUSION: We propose that the two-donor method lacks efficiency because it relies on two simultaneous recombination events in cis, an outcome that is dwarfed by pervasive accompanying undesired editing events. The methods that use one-donor DNA are fairly efficient as they rely on only one recombination event, and the probability of correct insertion of the donor cassette without unanticipated mutational events is much higher. Therefore, one-donor methods offer higher efficiencies for the routine generation of cKO animal models.