Existence nukleových kyselin volně cirkulujících v plazmě byla sice odhalena již kolem poloviny minulého století, s nástupem nových citlivých technologií – především kvantifikace specifických sekvencí pomocí Real-Time PCR se jejich analýza dostala do popředí zájmu molekulárních genetiků a klinických pracovníků hledajících nové efektivní markery pro využití v klinické medicíně. Kvalitativní i kvantitativní analýza volně cirkulujících nukleových kyselin zaznamenala obrovský nárůst počtu studií především ve vztahu ke studiu karcinogeneze, detekce nádoru, monitorování jejich rozvoje či úspěšnosti terapie. Objev volné DNA fetálního původu v mateřské plazmě byl příčinou nástupu efektních diagnostických strategií umožňujících neinvazivní prenatální diagnostiku. Současnost je charakterizována snahou o využití kvantitativní analýzy celkového množství volně cirkulující DNA (cfDNA) v oběhu jako prognostického markeru u pacientů s polytraumaty, mozkovou příhodou či akutním infarktem myokardu. Recentní studie prokázaly korelaci zvýšených hodnot celkové cfDNA s přežíváním pacientů jednotek intenzivní péče. Z výše vedených důvodů považujeme za důležité rozvíjení znalostí o chování cfDNA v cirkulaci za patologických podmínek, k nimž nepochybně narušení funkce ledvin patří. Této oblasti byla zatím ve světové literatuře věnována poměrně malá pozornost. Pouze dvě studie se dosud zabývaly změnami koncentrací cfDNA u hemodialyzovaných pacientů, obě prokázaly významný nárůst celkové koncentrace cfDNA v plazmě pacientů bezprostředně po proceduře. Vzhledem k výše uvedeným potenciálním klinickým aplikacím stanovení cfDNA v plazmě pacientů se jedná o důležité zjištění mající dopad na vývoj diagnostické strategie u pacientů, jejichž klinický stav vyžaduje hemodialýzu. V našem příspěvku diskutujeme současné znalosti v této oblasti a další úkoly a perspektivy, které studium cfDNA přináší nejen nefrologum.

Though circulating free nucleic acids in plasma were first described in 1950s, it was the advent of new sophisticated technologies – namely the quantification of specific sequences using real-time PCR – that made it a highly attractive target for molecular geneticists and clinicians looking for new effective markers applicable in clinical medicine. There has been an enormous increase in the number of studies analyzing qualitatively and quantitatively the circulating free nucleic acids, namely with regard to carcinogenesis, tumor detection and its progression or treatment monitoring. The discovery of free DNA of fetal origin in maternal plasma has enabled efficient strategies of non-invasive prenatal diagnostics. Quantitative analysis of total circulating free DNA (cfDNA) has recently been utilized and evaluated as a prognostic marker in the patients with polytrauma, stroke, or acute myocardial infarction. Recent studies have proven a correlation between the increased levels of total cfDNA and patient survival in the intensive care units. We therefore consider further studies on cfDNA level changes in various diseases, including renal failure, as important. In nephrology, however, these questions have only rarely been addressed. Only two studies have reported cfDNA plasma level changes in hemodialyzed patients; in both a significant increase immediately after the procedure was found. In accord with the above-mentioned possible clinical applications of cfDNA measurement, this is an important finding that might affect our diagnostic strategies in hemodialyzed patients. In this article we discuss the current knowledge in the field, as well as further tasks and perspectives regarding cfDNA measurement not only in nephrology.

• MeSH
• dialýza ledvin metody   trendy   využití   MeSH
• DNA izolace a purifikace   krev   MeSH
• genetické markery MeSH
• lidé MeSH
• medicína založená na důkazech trendy   MeSH
• nádory ledvin diagnóza   genetika   MeSH
• nefrologie metody   trendy   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• prognóza MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• extrachromozomální dědičnost MeSH
• Streptomyces MeSH

Úvod: Nemocní s pokročilými stadii zhoubných novotvarů mívají často zvýšené hladiny cirkulující volné DNA (cell-free DNA, cfDNA) v periferní krvi. Část cfDNA pocházející z tumoru představuje zdroj materiálu pro molekulární profilaci tumoru především za účelem predikce léčebné odpovědi biologické cílené léčby. Ve skupině nemocných s pokročilým NSCLC jsme s využitím detekce nádorově-specifických mutací sledovali výskyt nádorové složky cfDNA a v ní následně prováděli metylační vyšetření zaměřená na panel 30ti genů. Metodika: V souboru 107 NSCLC pacientů jsme v tumorózní tkáni vyšetřovali přítomnost somatické mutace EGFR nebo KRAS. U pacientů s nalezenou mutací byla vyšetřena přítomnost dané mutace v cfDNA získané z plazmy. U pozitivních vzorků bylo provedeno vyšetření DNA metylace v cfDNA. Výsledky: Z celkového počtu 107 pacientů ve studii byla některá z mutací EGFR nebo KRAS nalezena u 26 pacientů (14 x EGFR, 12 x KRAS). Z tohoto počtu byla přítomnost tumorové cfDNA detekována v plazmě 8 pacientů, u kterých bylo následně provedeno metylační vyšetření. U 7 cfDNA-pozitivních pacientů (7/8, 87 %) byla potvrzena shoda metylace v tumoru i v cfDNA u minimálně 3 ze sledované sady genů. Závěr: Přítomnosti cfDNA v plazmě pacientů s pokročilým NSCLC může být využita pro profilování primárního tumoru, a to jak pro neinvazivní vyšetřování genových mutací, tak i pro vyšetřování metylačních nádorových aberací majících význam pro biologické chování nemalobuněčného karcinomu.

Introduction: Patients in advanced stages of cancer often display elevated levels of circulating cell-free DNA (cfDNA) in peripheral blood. The part of cfDNA originating from a tumor represents a viable source of material for molecular profiling of the tumor, mainly in order to predict the biological response of targeted therapy. In a group of patients with advanced NSCLC, the frequency of tumor cfDNA was assessed by detecting tumor-specific gene mutations. The tumor cfDNA was subsequently subjected to methylation analysis using a panel of 30 genes. Methods: In a group of 107 NSCLC patients, primary tumor tissue was evaluated for the presence of somatic mutations in EGFR and KRAS genes. In mutation-positive patients, the presence of a particular mutation in cfDNA obtsdned from plasma was studied. The positive samples were subjected to analysis of DNA methylation in cfDNA. Results: Either of the EGFR or KRAS mutations was found in 26 out of the 107 patients (EGFR 14 x, KRAS 12 x). Of those, eight were found to have tumor cfDNA present in plasma. Subsequently, they underwent methylation tests. In 7 of these cfDNA-positive patients (87 %), methylation was found in both tumor and cfDNA in at least 3 of the observed set of genes. Conclusion: The presence cfDNA in plasma of patients with advanced NSCLC may be used for primary tumor protiling, for both non-invasive investigation of gene mutations and investigation of tumor methylation aberrations of relevance for the biological behaviour of non-small cell lung carcinoma.

• Klíčová slova
• mutace EGFR, mutace KRAS, cirkulující volná DNA, nemalobuněčný karcinom,
• MeSH
• biologická terapie metody   využití   MeSH
• financování organizované MeSH
• geny erbB-1 genetika   MeSH
• geny ras genetika   MeSH
• lidé MeSH
• metylace DNA genetika   MeSH
• mutace genetika   MeSH
• nádorové cirkulující buňky MeSH
• nemalobuněčný karcinom plic genetika   krev   MeSH
• statistika jako téma MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Výskyt krátkých fragmentů volných DNA (cell-free DNA – cfDNA) jaderného či mitochondriálního původu v tělesných tekutinách je fyziologický. Jejich koncentrace násobně narůstá následkem zranění, zánětu či intenzivní fyzické námahy. Zvýšené koncentrace se rychle vracejí na původní hladiny díky masivní degradaci restrikčními endonukleázami a extenzivnímu katabolizmu v játrech, slezině a částečně i díky vylučování ledvinami. Vyšší koncentrace cfDNA byly popsány v souvislosti s přítomností většiny rizikových faktorů aterosklerózy. Existuje silná korelace mezi cfDNA a koncentracemi kreatinkinázy a troponinu. cfDNA může být použita jako marker cévní mozkové příhody či k rozlišení STEMI a nonSTEMI infarktu myokardu. Mitochondriální cfDNA pak stimuluje zánětlivé procesy. Přestože řada nálezů potřebuje ověřit na rozsáhlejších souborech, cfDNA se mohou v budoucnu stát novými slibnými markery onemocnění a zdravotních prognóz i v kardiologii.

The presence of short fragments of cell-free DNA (cfDNA), of nuclear or mitochondrial origin, in body fluids is physiological. Their concentration increases manifold as a result of injury, inflammation or intensive physical exercise. Increased concentrations quickly return to their baseline levels due to intense degradation by restriction endonucleases and extensive catabolism in the liver, spleen and partly excretion by the kidneys. Higher cfDNA concentrations have been described in association with the presence of majority atherosclerosis risk factors. There is a strong correlation between cfDNA and creatine kinase and troponin concentrations. CfDNA can be used as a marker of stroke or to differentiate between STEMI and non-STEMI myocardial infarction. Mitochondrial cfDNA then stimulates inflammatory processes. Although many of the findings need validation on larger datasets, cfDNAs may become new promising markers of disease and health prognosis in the future also in cardiology.

• MeSH
• biologické markery MeSH
• kardiovaskulární nemoci * diagnóza   krev   MeSH
• krevní plazma fyziologie   MeSH
• lidé MeSH
• volné cirkulující nukleové kyseliny * fyziologie   krev   metabolismus   terapeutické užití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Volná cirkulující DNA (cf‑DNA) je charakterizována jako extracelulární DNA, která může být přítomna v nízkých koncentracích v krvi zdravých jedinců. Cf‑DNA je do krevního řečiště uvolňována apoptózou, ale i nekrózou. Zvýšené hladiny se vyskytují u patologických stavů, jako je zánět, stres či autoimunitní onemocnění. Výrazně zvýšené hodnoty cf‑DNA jsou patrné zejména u pacientů s malignitami, a to především v pokročilých stadiích nemoci. V takovémto případě je nádorově specifická cf‑DNA uvolňována nekrózou z buněk primárního nádoru a metastáz. V poslední době se hodně studií zabývá tzv. liquid biopsy (tekutou biopsií), která umožňuje poměrně snadnou detekci cirkulujících nádorových buněk i cirkulujících molekul nukleových kyselin z periferní krve k diagnostice nádorových onemocnění. Kvantitativní stanovení a detekce genetických a epigenetických změn v cf‑DNA u pacientů s různými malignitami má potenciální využití v molekulární diagnostice, prognóze, monitorování průběhu nemoci a odpovědi na léčbu. Tento článek je zaměřen na potenciální využití cf‑DNA jako krevního biomarkeru u vybraných solidních nádorů a hematologických malignit.

Circulating cell‑free DNA (cf‑DNA) is characterized as extracellular DNA that may be present in the blood of healthy individuals in low concentrations. Cf‑DNA is released by apoptosis or necrosis into the bloodstream. Increased levels are found in pathological conditions, such as inflammation, autoimmune diseases, or stress. Significant increase of cf‑DNA is particularly evident in patients with malignancies, especially in the advanced stages of the disease. In this case, the tumor specific cf‑DNA is released by necrosis from the cells of primary tumor and metastases. Recently, many studies concentrate on the so‑called ‘liquid biopsies’ that allow detection of circulating tumor cells and circulating nucleic acids from peripheral blood for tumor diagnostics. Quantitative methods and detection of genetic and epigenetic alternations of cf‑DNA in patients with different malignancies have potential applications in molecular diagnosis, prognosis, monitoring of disease progression and response to treatment. This review focuses on potential utility of cf‑DNA as a blood biomarker in selected solid tumors and hematologic malignancies. Key words: circulating cell‑free DNA – tumor marker – solid tumors – hematological malignancies This study was supported by grant of Internal Grant Agency of the Czech Ministry of Health NT14575. The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 13. 3. 2015 Accepted: 18. 5. 2015

• MeSH
• biopsie metody   MeSH
• DNA * diagnostické užití   genetika   krev   MeSH
• hematologické nádory genetika   krev   MeSH
• kolorektální nádory krev   MeSH
• lidé MeSH
• metylace DNA MeSH
• mutace MeSH
• nádorové biomarkery MeSH
• nádory plic genetika   krev   MeSH
• nádory prsu genetika   krev   MeSH
• nádory * genetika   krev   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

• Klíčová slova
• testování volné DNA,
• MeSH
• analýza určování pohlaví * metody   MeSH
• chromozom Y ultrastruktura   MeSH
• lidé MeSH
• mapování chromozomů metody   MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• sekvenční analýza DNA * metody   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• klinická studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Od svého objevu v 50. letech minulého století nabývá teprve v současné době fenomén existence volné lidské DNA v různých tělních tekutinách na svém významu. Přítomnost volné lidské DNA v různých tělních tekutinách s sebou přináší lákavé možnosti v diagnostice a/či monitoraci řady onemocnění či klinických stavů. Jedná se o poměrně novou metodu, u níž není doposud dosaženo standardu v laboratorním postupu. Rovněž její klinický význam musí být ve většině uvažovaných klinických situacích teprve určen. Předkládaný text představuje přehled současného postavení stanovení hladin volné DNA v rozličných tělních tekutinách za různých klinických stavů.

Despite being discovered long time ago – in the 50th of the previous century, the existence of free cell human DNA in different body fluids is getting its importance only in the last decade. The presence of the free cell human DNA in different body fluids gives us new opportunities in diagnosis and/or in follow up of different diseases or clinical settings. Being a relatively new method, even its methodology is waiting to be standardized, as well its clinical role under different clinical courses. The aim of this text is to review the current literature concerning free cell DNA importance under different clinical situations.

• MeSH
• DNA analýza   genetika   MeSH
• lidé MeSH
• nádory diagnóza   genetika   krev   MeSH
• nemoci pojiva diagnóza   genetika   MeSH
• prenatální diagnóza metody   využití   MeSH
• tělesné tekutiny MeSH
• transplantace trendy   MeSH
• traumatologie metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

As the number of cancer patients globally increases, a need for reliable biomarkers including circulating tumour DNA from liquid biopsy for diagnosis, prognosis and monitoring of the disease is rising. Currently, mainly tissue samples from biopsy are used, but there are certain limitations: firstly, it is an invasive technique, and secondly, in some cases it is almost impossible to obtain an acceptable tissue sample. This could be changed by using circulating cell-free DNA from liquid biopsy, which also gives the possibility of repeated examination. Here, we focus on the options of isolating circulating cell-free DNA from plasma samples using two isolation techniques: precision manual QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit and automatic MagNA Pure Compact (MPC) using Nucleic Acid Isolation Kit I. Manual extraction gave significantly better yields of circulating tumour DNA (P < 0.05). This DNA also had less contaminants (organic compounds or proteins). DNA obtained by both tested methods of isolation is suitable for subsequent molecular genetic methods.

• MeSH
• cirkulující nádorová DNA * MeSH
• lidé MeSH
• nádory * MeSH
• tekutá biopsie MeSH
• volné cirkulující nukleové kyseliny * MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

Transplantace plic je dynamicky se rozvíjející metodou léčby pokročilých stadií plicních onemocnění parenchymového nebo cévního původu. Přes významný pokrok v této oblasti je dlouhodobé přežití příjemců transplantace plic kratší ve srovnání s ostatními transplantacemi solidních orgánů. Důvodem je skutečnost, že plíce jsou vysoce imunogenní, otevřený systém v neustálém kontaktu se zevním prostředím, což vede k vyššímu výskytu infekcí a imunitních komplikací. K odlišení jednotlivých typů poškození štěpu se v současnosti používá řada vyšetřovacích metod, počínaje funkčním vyšetřením plic a zobrazovacími metodami, následovanými mikrobiologickými, imunologickými a bioptickými vyšetřeními. Tyto klinické nástroje však postrádají citlivost k zachycení časné subklinické změny štěpu, která předchází její klinické manifestaci až o několik měsíců. Z nových biomarkerů je klinické implementaci nejblíže vyšetření volné cirkulující dárcovské DNA. Současný stav výzkumu této nejmodernější metody v oblasti transplantace plic je předmětem tohoto přehledového sdělení.

x

• Klíčová slova
• volná cirkulující DNA dárce,
• MeSH
• biologické markery krev   MeSH
• DNA analýza   MeSH
• lidé MeSH
• rejekce štěpu * diagnóza   etiologie   klasifikace   MeSH
• transplantace plic * dějiny   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Cíl studie: Posoudit míru fragmentace volné fetální DNA v plazmě těhotných žen v průběhu těhotenství. Typ studie: Zjištění efektivity záchytu fetálních DNA molekul s rozdílnou délkou a volné fetální DNA ve velikostních frakcích. Pracoviště: Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny FN Olomouc. Metodika: 1. Celkem 363 vzorků těhotných žen v rozmezí 4. až 37. t.g. bylo posouzeno v lokusech STR a AMELY analýzou efektivity QF PCR. 2. Fetální DNA rozdělená do velikostních frakcí byla kvantifikována metodou QF PCR u 91 těhotných (8. t.g. - 40. t.g.). 3. Real-time PCR (SRY/vnitřní kontrola) byla použita u 22 těhotných s plodem mužského pohlaví (9. t.g - 36. t.g.). Výsledky: 1. Efektivita QF PCR byla nepřímo úměrná délce amplifikovaných molekul. 2. Kvantifikací fragmentů fetální DNA kapilární elektroforézou nebyly kromě frakce obsahující nejdelší molekuly (frakce 500-760 bp) nalezeny odlišnosti ve vztahu k týdnu těhotenství. 3. Metodou real-time PCR byl pozorován nepřímý vztah mezi množstvím fetální DNA ve frakci 150-300 bp a stadiem gravidity. Závěr: Rozborem všech tří postupů byl pozorován trend, který naznačuje nárůst větších fetálních molekul v průběhu těhotenství, zatímco množství menších molekul fetálního původu se nemění.

Aim of study: To assess cell free fetal DNA (cffDNA) fragmentation rate in pregnant women during the course of gravidity. Study design: QF PCR efficiency in cffDNA and quantitative analyses in particular cffDNA molecular size fractions. Setting: The study was performed at Department of Medical Genetics and Fetal Medicine, University Hospital Olomouc. Method: 1. 363 plasma DNA samples from women in different week of pregnancy (from 4th w.g. to 37th w.g.) were tested for QF PCR efficiency in particular STRs and AMELX/Y. 2. Size fractionated cff DNA (150–300 bp, 300–500 bp, 500–760 bp) was quantified by QF PCR in 91 pregnant women (from 9th w.g. to 40th w.g.). 3. Size fractionated cff DNA from male fetuses was quantified by real time PCR (SRY/internal control) in 22 pregnant women (from 9th w.g. to 36th w.g.). Results: 1. QF PCR efficiency decreased from longer to shorter molecules. 2. The only 500 -760 bp fraction showed cffDNA increase in relation to week of gravidity. 3. Indirect relation between amount of cffDNA and week of gravidity was found in 150-300 bp fraction by Real-time PCR. Conclusion: Assembling of all 3 approaches indicates increase of longer cffDNA molecules during the gravidity while level of the short cffDNA molecule fragments probably remains from the approximately 9th w.g. the same.

• Klíčová slova
• neinvazivní prenatální diagnostika, real-time PCR, QF PCR, velikostní frakce,
• MeSH
• DNA krev   MeSH
• elektroforéza kapilární MeSH
• fragmentace DNA MeSH
• lidé MeSH
• lidské chromozomy X genetika   MeSH
• lidský chromozom Y genetika   MeSH
• mikrosatelitní repetice genetika   MeSH
• plod MeSH
• polymerázová řetězová reakce MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• těhotenství MeSH
• ženské pohlaví MeSH