Positional cloning in bread wheat is a tedious task due to its huge genome size and hexaploid character. BAC libraries represent an essential tool for positional cloning. However, wheat BAC libraries comprise more than million clones, which makes their screening very laborious. Here, we present a targeted approach based on chromosome-specific BAC libraries. Such libraries were constructed from flow-sorted arms of wheat chromosome 7D. A library from the short arm (7DS) consisting of 49,152 clones with 113 kb insert size represented 12.1 arm equivalents whereas a library from the long arm (7DL) comprised 50,304 clones of 116 kb providing 14.9x arm coverage. The 7DS library was PCR screened with markers linked to Russian wheat aphid resistance gene DnCI2401, the 7DL library was screened by hybridization with a probe linked to greenbug resistance gene Gb3. The small number of clones combined with high coverage made the screening highly efficient and cost effective.
- MeSH
- chromozomy rostlin genetika MeSH
- fluorescence MeSH
- hybridizace nukleových kyselin genetika MeSH
- karyotypizace MeSH
- klonování DNA metody MeSH
- mikrosatelitní repetice genetika MeSH
- mšice fyziologie MeSH
- nemoci rostlin genetika imunologie parazitologie MeSH
- polymerázová řetězová reakce MeSH
- přirozená imunita genetika MeSH
- pšenice genetika imunologie parazitologie MeSH
- rostlinné geny genetika MeSH
- umělé bakteriální chromozomy genetika MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Východiska: Chromosomální translokace zahrnující imunoglobulinové lokusy (14q32/IGH, 2p11/IGK a 22q11/IGL) hrají důležitou roli v patogenezi B-buněčných leukémií a lymfomů. Jejich výsledkem je deregulace transkripce onkogenů zahrnutých do těchto translokací, která je způsobená jejich juxtapozicí s IGH transkripčními enhancery. Pro identifikaci nádorových genů lokalizovaných v blízkosti zlomových míst chromosomových translokací lze použít fluorescenční in situ hybridizaci (FISH). Nicméně běžně užívaná mapovací strategie metodou FISH vyžaduje velký počet experimentů se sondami vybranými ze zkoumané oblasti a spotřebuje značné množství cytogeneticky zpracovaného nádorového materiálu. Jedním z alternativních přístupů je array komparativní genomická hybridizace (aCGH), rychlá technika na úrovni DNA, která používá jen malé množství nádorového materiálu. Narozdíl od metody FISH však dovoluje určit pouze nebalancované změny. Cílem této práce bylo ukázat, že aCGH je efektivní nástroj k rychlému mapování zlomových míst nereciprokých IGH translokací u B-buněčných leukémií a lymfomů. Materiál a metody. Pro tuto studii jsme vybrali jednoho pacienta s B-buněčnou chronickou lymfocytární leukémií (CLL) s komplexním karyotypem a nebalancovanou translokací der(14)t(1; 14)(q25;q32) zahrnující IGH. Ke genomickému profilování tohoto případu jsme použili metodu aCGH s rozlišením 1 megabáze (Mb). Validace výsledků aCGH byla provedena pomocí metafázové FISH s BAC klony a celochromosomovými malovacími sondami. Výsledky a závěry. Během jednoho aCGH experimentu bylo identifikováno osm aberantních oblastí (4 zmnožení a 4 ztráty genetického materiálu). Podle našeho očekávání tyto abnormality zahrnovaly také duplikaci 1q zahrnuté do tranlokace der(14)t(1;14). Byly identifikovány dva po sobě následující BAC klony ohraničující zlomové místo v oblasti 1q21.3. Tyto klony byly posléze použity pro metafázovou FISH, která potvrdila aCGH nález. Navzdory 1 Mb rozlišení použitého chipu, byly od sebe tyto dva konkrétní klony odděleny oblastí přibližně 3 Mb velkou. Vzhledem k tomu, že v této oblasti se vyskytuje velké množství genů, je k identifikaci kandidátního genu ležícího v oblasti zlomu nezbytné další mapování za pomocí BAC klonů, a CGH výsledky nám navíc pomohly opravit původní cytogenetický nález a přesně určit změny karyotypu u tohoto pacienta. Naše data poskytují další důkaz toho, že aCGH je efektivní technika pro molekulární karyotypování nádorů a umožňuje rychlé mapování genomických změn, včetně zlomových míst nereciprokých translokací. Ty mohou být detekovány s vysokou přesností a citlivostí během jediného experimentu, jak ukazuje naše práce.
Background: Chromosomal translocations involving immunoglobulin loci (14q32/IGH, 2p11/IGK and 22q11/IGL) play an important role in pathogenesis of B cell leukemia and lymphoma. These aberrations lead to deregulated transcription of targeted oncogenes by their juxtaposition with the IGH transcriptional enhancer(s). Fluorescent in situ hybridization (FISH) showed to be a potential tool for identification of cancer-related genes located in breakpoint regions of chromosomal translocations. However, the commonly used „probe-mapping“ FISH strategy requires numerous experiments with consecutively selected probes from the narrowed down region and uses a significant amount of cytogenetic material. One of the alternative approaches, array comparative genomic hybridisation (aCGH), is a rapid technique that operates on DNA level and uses only a small amount of tumor material. In contrast to FISH, however, it analyzes only unbalanced aberrations. The aim of this study was to evaluate array comparative genomic hybridisation (aCGH) as a potential tool for a rapid mapping of breakpoint of non- reciprocal IGH-associated translocation in B cell leukemia and lymphoma. Material and methods. For this study, we selected one case of B cell chroniclymphocytic leukemia (CLL) with a complex karyotype including unbalanced der(14)t(1;14)(q25;q32) involving IGH. Genomic profiling of this case was performed using 1 megabase (Mb) aCGH. Validation of aCGH results was done by metaphase FISH with Bacterial Artificial Chromosome (BAC) clones and chromosome painting probes. Results and conclusions. In one single aCGH experiment eight regions of genomic imbalances (4 gains and 4 losses) were identified. As expected, these imbalances included also duplication of 1q due to the der(14)t(1;14). Two consecutive BAC clones flanking the proximal breakpoint at 1q21.3 have been identified. These clones were further applied for metaphase FISH analysis that confirmed aCGH findings. Despite of 1 Mb resolution of the applied platform, these particular clones are separated by approximately 3 Mb. Given that this region is gene-rich, further BAC-mapping is required to identify the candidate gene located in the breakpoint region. Moreover, aCGH data helped us to correct original cytogenetic findings and precisely define karyotypic changes in this case. Our data provide additional evidence that aCGH is a powerful technique for molecular karyotyping of tumors and allows a rapid mapping of genomic imbalances, including breakpoints of non-reciprocal translocations. As shown in this study, the latter can be detected with high accuracy and sensitivity during a single experiment.
- MeSH
- chronická lymfatická leukemie diagnóza etiologie genetika MeSH
- financování organizované MeSH
- genetický výzkum MeSH
- geny pro imunoglobuliny genetika MeSH
- hybridizace genetická MeSH
- hybridizace in situ fluorescenční metody využití MeSH
- hybridizace nukleových kyselin genetika metody MeSH
- lékařská onkologie metody trendy MeSH
- lidé MeSH
- lymfom diagnóza etiologie genetika MeSH
- onkogeny genetika imunologie MeSH
- senioři MeSH
- srovnávací genomová hybridizace MeSH
- translokace genetická genetika MeSH
- umělé bakteriální chromozomy genetika MeSH
- zlomy DNA MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- senioři MeSH
