Východisko. Z vysoce citlivých molekulárně biologických metodik využívaných při monitorování léčby hemato-onkologických pacientů mohou být proto pro klinická využití přínosnější a jsou žádanější metodiky kvantifikující umožňující predikci i odhad odpovědi na léčbu. Mnohdy, spíše než absolutní kvantifikace, může být informativní i relativní výsledek metodik využívajících stanovení konečného množství amplifikačních produktů, např. komparativní polymerázové řetězové reakce (PCR). Metody a výsledky. Naše provedení komparativní PCR využívá optimalizované duplexní koamplifikace specifické sekvence, kterou je bud' klonální restrukturace genu pro těžký imunoglobulinový řetězec CDR3 nebo sekvence úseku interchromozomální translokace t(14;18) - bc12/Jh a vnitřního standardu, úseku genu Hras 1 (ras). Tyto koamplifikace jsou prováděny s dlouhodobě uchovávanými vzorky DNA z kostních dření a periferní krve paralelně v jediném běhu PCR a poté jsou gelovou denzitometrií kvantifikovány poměry produktů této duplexní reakce v její exponenciální fázi. Metodika byla využita v průběhu několika měsíců až několika let při monitorování nemocných nehodgkinským maligním lymfomem (NHL) léčených konvenční terapií, vysokodávkovou terapií s následnou transplantací kmenovými buňkami nebo terapií monoklonální protilátkou anti CD20 (Rituximab). Při 50 kvantitativních molekulárních analýzách, které byly doplněny klinickými údaji až dodatečně, byl zjištěn souhlas s konstatováními klinickými ve všech případech klesajícího nebo stoupajícího množství markerů, u některých pacientů, u nichž bylo dosaženo PCR negativity, došlo později opět k PCR pozitivitě. Výsledky zjištěné v kostní dřeni se shodovaly s výsledky z periferní krve. Výsledky dosažené pomocí komparativní PCR se shodovaly s výsledky zjištěnými užitím PCR v reálném čase. Závěry. Komparativní PCR je využitelná při monitorování účinnosti léčby. Možnost prediktivních závěrů na základě těchto výsledků závisí na frekvenci odběrů vzorků a na stupni citlivosti detekce, který by měl být nezbytně stanoven u negativních případů.

Background. PCR techniques detecting interchromosomal translocation and clonal immunoglobulin gene rearrangement (IgH) as disease markers in non-Hodgkin's lymphomas (NHL) has been utilised past ten years. However, qualitative PCR detection of persisted minimal residual disease cannot provide clinically useful prognostic information and presently, quantitative approaches are required to predict patient outcome and assess response to the treatment. In some cases, „end-point" quantifying techniques, such as comparative PCR, are applicable and the relative estimation of differences in target quantity may serve in disease monitoring rather than absolute number of target copies. Methods and Results. Our method of comparative PCR employs co-amplification of sequences of interest (clonal CDR3, bc12/Jh) and the segment of Hras 1 gene(ras) as an internal standard. Serial dilutions of stored diagnostic DNAs from blond and bone marrow are examined in the same PCR and, after gel densitometry, the amount of initial target is assessed by comparing exponential products of co-amplification. The comparative PCR assay was utilized in monitoring of NHL patients cured either with conventional therapy, or with high-dose regimens and transplantation with stem cells, or with chimaeric anti-CD20 monoclonal antibody (Rituximab). Results from 50 monitored intervale obtained during several months up to several years were supplemented with clinical statements retrospectively. Some of patients became PCR-negative, reappearance of PCR-pozitivity was observed as well. The decrease or increase of disease marker corresponded to clinical observations. Results obtained from bone marrow were in agreement with those obtained from blond. Conclusions. End-point quantifying PCR comparative assay may provide an information on the increased risk of relapse and impact of the therapy. The predictive value of these methods depends on the frequency of sample taking and on the sensitivity of the method, which should be monitored in negative cases.

1 interní klinika 1 LF UK a VFN Praha

Clinical relevance of semi-quantitative monitoring by comparative PCR in lymphomas

Klinická relevance semikvantitativního monitorování lymfomů užitím komparativní polymerázové řetězové reakce = Clinical relevance of semi-quantitative monitoring by comparative PCR in lymphomas : přednes. na 5. celostát. konf. DNA diagnostiky s mezinárodní účastí, Praha, Lékařský dům, 14.-15.12.2001 /

Clinical relevance of semi-quantitative monitoring by comparative PCR in lymphomas : přednes. na 5. celostát. konf. DNA diagnostiky s mezinárodní účastí, Praha, Lékařský dům, 14.-15.12.2001 /

Lit: 13

Souhrn: eng