Východisko. Kvantifikace fluorescenčně značených PCR produktů na kapilární elektroforéze (QF PCR) má své limity především v citlivějších analýzách, ve kterých je potřebné zachytit minoritní buněčnou linii a rozpoznat malé změny v závislosti na čase. V těchto případech může být chyba měření a reprodukovatelnost výsledků velmi ovlivněna hlavně lidským faktorem a efektivitou PCR. Hlavním cílem studie bylo posoudit a optimalizovat kvantitativní možnosti inovované QF PCR s přímou návazností na kvantifikaci Y sekvencí u gonozomálních mozaik. Metody a výsledky. Arteficiálně vytvořené Y/X DNA mozaiky byly testovány a kvantifikovány inovovanou QF PCR, která nahrazuje a rozšiřuje real-time PCR. Na základě porovnání intenzity fluorescence PCR produktů po jednotlivých cyklech byly sestrojeny grafy nárůstu fluorescence pro různá ředění. Analýzou podílu signálu vnitřní kontroly a příslušné mozaiky byla sestrojena kalibrační křivka pro kvantifikaci Y sekvencí. Pro výpočet vzácných mozaik byl sestaven empirický vzorec. Závěry. Rozšíření QF PCR o manuální real-time PCR eliminuje meze QF PCR a zpřesňuje kvantifikační analýzy založené na PCR. Novelizovaný DNA diagnostický přístup – IQF PCR, který se vyznačuje vysokou citlivostí a přesností, umožňuje významný posun v analýze gonozomálních Y/X mozaik.

Background. Quantification of fluorescence labelled PCR products on capillary electrophoresis (QF PCR) has limits primarily in the possibility of more sensitive analyses to detect minority cell lines and small time related variations. PCR efficiency and human factor affect measuring error and reproducibility of results in these cases. The aim of this work was to assess and optimise of innovated (I)QF PCR in quantification of Y sequences in gonosomal mosaics. Methods and Results. Artificially prepared Y/X mosaics were tested and quantified by IQF PCR, which replaces real-time PCR. Comparison of relative fluorescence to PCR cycles in different Y/X dilutions was plotted on the graphs. Calibration curve for Y sequences quantification was set by the analyses of ratio of Y/X fluorescent signals. An empirical formula was created for the rare mosaic calculation. Conclusions. QF PCR refined by manual real-time PCR eliminates limits of QF PCR and specifies quantitative analyses based on PCR. The outstanding feature of IQF PCR is its high sensitivity and accuracy in quantification of Y/X gonosomal mosaics.

Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny lF UP a FN Olomouc

Prospects and applications of innovated quantitative fluorescent PCR (IQF PCR) in analysses of genetic mosaics using gonosomal sequences

Možnosti a využití inovované kvantitativní fluorescenční PCR (IQF PCR) v analýze genetického mozaicizmu pomocí gonozomálních frekvencí = Prospects and applications of innovated quantitative fluorescent PCR (IQF PCR) in analysses of genetic mosaics using gonosomal sequences /

Prospects and applications of innovated quantitative fluorescent PCR (IQF PCR) in analysses of genetic mosaics using gonosomal sequences /

Lit: 8

Souhrn: eng