Východisko. U pacientů s chronickou myeloidní leukémií jsme detekovali zvýšenou hladinu exprese genu PCNA, který by se potenciálně mohl podílet na rozvoji onemocnění. Cílem této práce bylo nalézt vhodné podmínky pro transfekci molekul PCNA-siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7 s up-regulovaným PCNA a zvýšenou expresi tlumit. Metody a výsledky. Klíčovými parametry úspěšného vnášení siRNA do buněk jsou typ a množství transfekčního činidla, koncentrace buněk a vnášené siRNA nebo doba inkubace transfekovaných buněk před analýzou exprese. Byla testována tato činidla: ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) a siPORT Amine (Ambion). Účinnost transfekce siRNA značených fluoresceinem byla sledována pomocí fluorescenční mikroskopie. Míra potlačení genové exprese na úrovni mRNA byla stanovována pomocí RT-PCR v reálném čase a na proteinové úrovni metodou western blotů. Jako nejvhodnější byl pro další pokusy vybrán Oligofectamine, pomocí kterého bylo dosaženo 70% poklesu hladiny mRNA genu PCNA. Dále byla zvolena 50 nM koncentrace siRNA, 1x106 buněk/ml a množství Oligofectaminu 4 µl/1ml transfekovaných buněk. Nejvhodnější doba kultivace buněk po transfekci byla 48 hodin. Závěry. Na základě výsledků této práce byl navržen protokol pro vnášení siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7. Tuto techniku lze přenést i na další geny potenciálně přispívající k CML a sledovat dopad siRNA-inhibice genů na expresní profil takto ovlivněných buněk. siRNA proti některým z over-exprimovaných genů by navíc mohly být v budoucnu využity pro genovou terapii CML.

Background. Increased expression of PCNA gene was detected in chronic myeloid leukemia (CML) patients in our laboratory. The gene may participate in the disease development. The aim of the study was to develop appropriate conditions for PCNA-siRNA transfection into K562 and MOLM-7 cell lines (which both have the up-regulated PCNA gene) and to silence the increased expression. Methods and Results. Key parameters of successful siRNA delivery into the cells are type and quantity of transfection reagent, cells and siRNA concentration or cultivation time before an expression analysis. Transfection reagents ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) and siPORT Amine (Ambion) were tested. Transfection efficiency was monitored by fluorescence microscopy of fluorescein labeled siRNA. Gene silencing was determined at mRNA level by real-time PCR and at protein level by western blots. As the most suitable reagent was chosen Oligofectamine, which achieved 70% decrease of PCNA mRNA level. Further, 50 nM siRNA concentration, 1x106 cells/ml and amount of Oligofectamine 4 µl per 1 ml of transfected cells were selected. The best cultivation time after siRNA delivery was 48 h. Conclusions. Based on the results of this study, transfection method for siRNA delivery into the K562 and MOLM-7 cell lines was proposed. The procedure can be transferred also on further selected genes potentially involved in CML and afterwards it will be possible to monitor the impact of siRNA-inhibition on expression profile. In the future siRNAs against some over-expressed genes would be used for gene therapy of CML.

Specific silencing of PCNA gene expression in leukemic cell lines using siRNA

Cílené tlumení exprese genu PCNA pomocí siRNA v leukemických buněčných liniích = Specific silencing of PCNA gene expression in leukemic cell lines using siRNA /

Specific silencing of PCNA gene expression in leukemic cell lines using siRNA /

Lit. 9