Smíšená lymfocytární reakce (MLC) T-lymfocytů s dendritickými buňkami je jedním ze základních nástrojů studia imunologických mechanismů. Tato práce přináší popis nové metodiky hodnocení alogenní a autologní MLC pomocí průtokové cytometrie a diferenciálního gatingu. Metoda je založena na časově omezené akvizici událostí a na jejich rozdělení podle hodnot forward a side scatteru. Gatována je jednak populace všech živých buněk (R1), dále populace živých neproliferujících buněk (R2) a populace mrtvých/apoptotických buněk (R4). Pomocí fluorescenčních mikrosfér (R3) je navíc možno vypočítat absolutní množství buněk ve stanoveném gatu. Pomocí 7-AAD exkluze bylo ověřeno, že zhruba 90 % 7-AAD pozitivních buněk se promítá do gatu R4, navíc poměr R1: R2 výtečně koreluje s procentem buněk pozitivních na aktivační/proliferační marker CD71. Příklady dalších výsledků dosažených touto metodikou jsou uvedeny v textu. Vzhledem k tomu, že metoda diferenciálního gatingu ve své základní podobě nevyžaduje užití žádné fluorescenční protilátky, umožňuje rychlý a levný skríning velkého množství vzorků bez použití radioaktivně značených nukleotidů.

Mixed lymphocyte reaction (MLC) of T-lymphocytes with dendritic cells is one of the basic tools for studying of immune reaction mechanisms. This work describes a new method of evaluation of allogeneic and autologous MLC by flow cytometry and differential gating. This method is based on fixed time acquisition of events and their sorting according to their forward and side scatter properties. Differential gating distinguishes populations of all living cells (R1), living nonproliferating cells (R2) and dead/apoptotic cells (R4). Addition of fluorescence microspheres (R3) enables the calculation of absolute number of cells in a given sample volume. Using the method of 7-AAD exclusion, we have shown that approximately 90% of 7-AAD positive cells project into the R4 gate. Moreover, there was an excellent correlation between the R1: R2 ratio and the percentage of cells positive for activation/proliferation marker CD71. The method of differential gating in its basic version does not require use of any fluorescent antibody and therefore is suitable for rapid screening of large number of samples at reasonable cost and without the use of radiolabeled nucleotides.

1 interní hematoonkologická klinika VFN a 1 LF Praha

Flow cytometric differential gating strategy for evaluation of T-lymfocyte survival and proliferation in mixed lymphocyte reaction with dendritic cells

Hodnocení přežití a proliferace T-lymfocytů ve smíšené lymfocytární reakci s dendritickými buňkami metodou diferenciálního gatingu = Flow cytometric differential gating strategy for evaluation of T-lymfocyte survival and proliferation in mixed lymphocyte reaction with dendritic cells /

Flow cytometric differential gating strategy for evaluation of T-lymfocyte survival and proliferation in mixed lymphocyte reaction with dendritic cells /

Lit. 13