Východiska: K průkazu cytotoxického efektu T lymfocytů vůči cílovým, resp. nádorovým buňkám, je standardně používán in vitro test s radioaktivním chromem 51Cr. Tento test má však určité limitace, zejména vysoké procento nespecifického pozadí, nízkou citlivost a použití radioaktivních materiálů. Vědomi si těchto limitací zavedli jsme neradioaktivní cytotoxický test s využitím fluorochromu 5-(6-) karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl esteru (CFSE) a propidium iodidu. Obsah a cíle práce: Cílem práce bylo ověřit cytotoxický efekt protinádorových T lymfocytů neradioaktivním testem. Metody: Ve studii byl použit model specifických T lymfocytů cytotoxických vůči nádorové linii buněk mnohočetného myelomu ARH 77. Specifické cytotoxické T lymfocyty byly získané imunomagnetickou separací na základě produkce interferonu gama a expandované na potřebné množství. T lymfocyty byly barveny CFSE a kultivovány s nádorovými buňkami ARH 77, pozdně apoptotické a nekrotické buňky byly odlišeny barvením propidium jodidem a hodnoceny pomocí průtokové cytometrie. Výsledky: Nejprve byla nalezena optimální barvicí koncentrace CFSE (1μM). Cytotoxicita byla hodnocena při poměru efektorové:terčové buňky 2:1, 10:1 a 50:1 a to po 4, 24 a 48 hodinách kultivace. Specificita expandovaných T lymfocytů byla ověřena kultivací s alogenními mononukleárními buňkami a kultivací nespecifických T lymfocytů s buňkami nádorové linie ARH 77. Závěr: Takto zavedený test cytotoxicity je cenným nástrojem pro hodnocení efektorové složky imunitního systému a účinnosti protinádorových vakcín.

Objectives: Cytotoxicity test using radioactive chromium 51Cr has been standardly used to evaluate specific cytolytic activity of T lymphocytes. This test has some significant disadvantages because of the high non-specific background caused by spontaneous release of 51Cr from target cells, low sensitivity, and health risks associated with the use of a radioactive isotope. To avoid these limitations we have introduced a cytotoxicity test using 5-(6-) karboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) and propidium iodide (PI). Aim: The aim of this study was to evaluate cytotoxic effect of antigen-specific T lymphocyte using a non-radioactive test with CFSE and PI staining. Methods: The model of cytotoxic T lymphocytes specific to multiple myeloma cell line ARH 77 was used. Activated myeloma-specific T cells that produce interferon-γ were isolated using immunomagnetic beads and further expanded in vitro. T lymphocyte labeled with CFSE were co-cultured with ARH77 target cells. To identify target cells in late apoptosis or necrosis, PI was used and measured by flow cytometry. Results: The optimal staining concentration of CFSE has been found (1μM). Cytotoxicity has been evaluated with effector cells:target cells ratio 2:1, 10:1 and 50:1 after 4, 24 and 48 hours of in vitro cultivation. Tumor specificity has been verified by 2 sets of controls: third-party PBMC as negative control target cells and expanded CFSE-labeled interferon gamma negative fraction of T cells as negative control effector cells. Conclusion: The newly established cytotoxicity test is a valuable instrument to evaluate effector part of the immune system and efficacy of anticancer vaccines.

Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie FN Brno

Evaluation of antigen-specific lymphocytes anti-tumour effect with use of non-radioactive cytotoxicity test

Hodnocení protinádorového efektu antigen-specifických T lymfocytů s využitím neradioaktivního testu cytotoxicity = Evaluation of antigen-specific lymphocytes anti-tumour effect with use of non-radioactive cytotoxicity test /

Evaluation of antigen-specific lymphocytes anti-tumour effect with use of non-radioactive cytotoxicity test /

Lit. 24