Východiská: Odpoveďou onkoproteínu p53 na poškodenie DNA je indukcia zastavenia bunkového delenia (apoptózy). Mutácia génu TP53 (gén, ktorý kóduje proteín p53) je veľmi častá v humánnych malignitách a mení pôsobenie proteínu p53. Výsledkom je stabilná forma p53, ktorá sa hromadí v jadrách nádorových buniek súčasne so stratou jeho funkcie. Mutovaná p53 je stabilizovaná a ľahko imunohistochemicky (IHC) detegovateľná. Hladina p53 je v zdravých bunkách výrazne determinovaná proteínom MDM2 (murine double minute‑2). Tento spolupôsobí pri degradácii proteínu p53, a zároveň ho považujeme za potenciálny marker funkčnosti p53. Nadexpresia proteínu MDM2 predstavuje mechanizmus, ktorý môže počas tumorigenézy rušiť funkciu p53. Súbor a metódy: Stotridsaťšesť vzoriek karcinómu pľúc sme získali od pacientov, ktorí podstúpili radikálnu resekciu (lobektómiu alebo pulmonektómiu a lymfadektómiu). Patologická dia­gnóza bola stanovená na základe WHO kritérií. V našej štúdii sme sledovali expresiu proteínu p53 a proteínu MDM2, ktorý môže slúžiť ako IHC marker pre p53 status. Oba proteíny sme imunohistochemicky detegovali. Stanovili sme ich expresiu, ďalej sme porovnali ich výskyt s klinicko‑patologickými parametrami. Výsledky: Vo vzorkách p53 a MDM2 pozitívnych sme pozorovali silne tmavohnedo sfarbené jadrá nádorových buniek. Väčšina p53 pozitívnych vzoriek predstavovala skvamocelulárny typ (55 %), nasledovali vzorky veľkobunkového typu (53 %) a 26 % p53 pozitívnych vzoriek predstavoval adenokarcinóm. Ani jedna vzorka z iných typov neexprimovala p53. Ďalej sme porovnali výskyt p53 a stupeň malignity nádoru (grade). Zistili sme, že expresia p53 stúpa so stupňom malignity nádoru. Na štatistické vyhodnotenie sme použili chi‑kvadrátový test, ktorým sme dokázali štatistickú významnosť medzi expresiou p53 na jednej strane, a typom nádoru a stupňom malignity na strane druhej (p = 0,000425; p = 0,00157). S ohľadom na expresiu p53 a MDM2 sme zistili nasledovné: len deväť vzoriek bolo simultánne p53 a MDM2 pozitívnych. V 46 prípadoch (34 %) zvýšená hladina p53 bola kombinovaná s MDM2 negativitou. Ostatné vzorky boli buď negatívne na oba proteíny (71/52 %), alebo p53 negatívne a MDM2 pozitívne v počte 10/7 %. Záver: Vo väčšine štúdií je absencia p53 imunoreaktivity dávaná do súvisu s absenciou p53 mutácií. Platí to aj naopak, a síce, pozitívna expresia p53 je považovaná za znak mutácie p53, ktorý súvisí so stratou funkcie. V našej štúdii 34 % prípadov vykazovalo vysokú hladinu p53 bez expresie MDM2. Tieto nádory považujeme za tumory s inaktivujúcimi mutáciami, ktoré stabilizujú proteín p53. Na druhej strane nádory, ktoré exprimujú vysoké hladiny stabilnej p53 a sú súčasne pozitívne na MDM2 (v našom prípade 9 vzoriek/7 %) predstavujú skupinu s funkčnou p53. U tejto skupiny pacientov by sme mohli očakávať lepšiu prognózu. Kľúčové slová: onkoproteín p53 – MDM2 proteín – karcinóm pľúc – imunohistochémia

Background: The oncoprotein p53 protein induces cell growth arrest (apoptosis) in response to endo‑ or exogenous stimuli. Mutation of TP53 (gene encoding the p53 protein) is common in human malignancies and alters the conformation of p53. The result is a more stable protein which accumulates in nuclei of tumor cells with loss of function. Mutant p53 is stabilized, and it is possible to detect this form very clearly by immunohistochemistry (IHC). Expression of the MDM2 protein is used as a potential marker of p53 function. P53 levels in normal cells are highly determined by the MDM2 protein (murine double minute‑2) – mediated degradation of p53. MDM2 overexpression represents at least one mechanism by which p53 function can be abrogated during tumorigenesis. Material and Methods: Lung carcinoma samples were obtained from patients, who underwent radical resection (lobectomy or pulmonectomy and lymphadectomy). Pathological dia­gnosis was based on the WHO criteria. In our study, we investigated the expression of p53 and MDM2 protein that might improve IHC as a marker for p53 status. Proteins were IHC detected in 136 samples of primary lung carcinoma. Immunostaining results of p53 positive samples were compared to IHC expression of MDM2 positive and MDM2 negative samples. Results: Strong brown nuclear staining was visible in p53 and MDM2 positive cells. The most p53 positive cases were samples of squamocellular carcinoma (55%), then samples of large cell carcinoma (53%) and 26% adenocarcinoma samples showed the p53 immunoreactivity. No one sample of different types was p53 positive. When we compared the p53 expression and grade of tumor, we found that the p53 expression increased with the grade of tumor. For statistical evaluation, the chi‑square test was used. The relationship between p53 expression and type of tumor, also the p53 expression and grade of tumor was statistically significant (p = 0.000425; p = 0.00157). Regarding p53 and MDM2 expression, only nine samples (7%) were simultaneously p53 and MDM2 positive. In 46 (34%) cases, elevation of p53 was combined with MDM2 negative expression. Other tumor samples were either negative for both proteins (71/52%), or p53 negative and MDM2 positive in 10 (7%) tumor samples. Conclusion: Absence of p53 staining in most studies indicates absence of p53 mutation, and on the contrary, positive expression of p53 is a sign of p53 mutations with loss of function. In our study, 34% of cases with extensively high level of p53 without increased level of MDM2 were identified. We suppose that these are tumors with inactivating mutations that stabilize p53. On the other hand, tumors with high level of stabilized wild‑type p53 protein and simultaneously with increased MDM2 staining (9 samples/7%) represent group with functional p53. In this group of patients, we could expect better prognosis with regard to function of p53 protein. Key words: oncoprotein p53 – MDM2 protein – lung cancer – immunohistochemistry This work was supported by the Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic VEGA: 1/0224/12; 1/0925/11; 1/0928/11. The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 13. 6. 2013 Accepted: 23. 7. 2013

Národný ústav tuberkulózy pľúcnych chorôb a hrudníkovej chirurgie Vyšné Hágy

Ústav anatómie LF UPJŠ Košice

Interaction between p53 and MDM2 in human lung cancer cells