Úvod a cíl: Na základě odklonu lidské regenerativní medicíny od xenogenních materiálů jsme zkoumali, zda je možné efektivně expandovat kmenové buňky zubní pulpy dočasných zubů (SHED) v médiu, které obsahuje minimální množství fetálního telecího séra; čímž je snížena pravděpodobnost přenosu zoonóz a vzniku prionové infekce. Již v roce 2011 jsme dokázali, že takový protokol je použitelný pro kmenové buňky stálých zubů (DPSCs). Naše hypotéza, že SHED by měly na stejné médium reagovat podobně, vychází z faktu, že ač se od sebe tyto dvě populace buněk odlišují expresí povrchových znaků, sdílejí místo vzniku a mají podobné niche. Metoda: Tři odlišné linie SHED, izolované pomocí enzymatické disociace, jsme kultivovali v médiu obsahujícím 2 % fetálního telecího séra (FCS) až do překročení Hayflickova limitu, čímž jsme prokázali jejich kmenovost. Následná fenotypová analýza kultivovaných SHED ukázala vysokou pozitivitu znaků mezenchymálních kmenových buněk, a tedy hodnoty charakteristické pro SHED. Poté, co jsme ověřili, že testovaná metoda izolace ani médium zásadně neovlivnilo fenotyp naší buněčné populace, jsme tyto buňky úspěšně diferencovali v následující unipotentní buněčné typy: osteoblasty, adipocyty, chondrocyty, neurální, endoteliální buňky a buňky kosterní svaloviny. Výsledky: Naše data prokazují, že v porovnání s SHED kultivovanými v médiích s ≥ 10 % fetálního telecího séra si i SHED izolované a kultivované za výše uvedených podmínek udržují vysoký proliferační potenciál. Exprimují stabilní, ač o něco slabší pozitivitu povrchových znaků (v řádu 20 %) a diferencují ve všechny doposud s nimi asociované buněčné typy. Závěr: Z našich výsledků vyplývá, že SHED jsou slibnou a výjimečně dosažitelnou buněčnou populací, a to především pro neuroregenerativní medicínu. Klíčová slova: kmenové buňky zubní pulpy dočasných zubů – SHED – xenogenní sérum – fetální telecí sérum – 2% FCS – enzymatické natrávení – diferenciační potenciál

Introduction and aims: Recently, the human regenerative medicine has been departing from the use of xenogeneic materials for the possibility of zoonosis transfer and development of prion infection. We have focused our research on cultivation of Dental Pulp Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth (SHED) in a medium with lowered concentration of Fetal Calf Serum (FCS), which decreases the chances of the above mentioned negative impacts on the cultivated cell population. In 2011, Karbanova et al. have shown that the Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) from Impacted Third Molars can be viably cultured in a xenogeneic medium containing as little as 2% FCS. Our hypothesis, that SHED should react similarly to isolation and cultivation methods as DPSCs, follows from their similarities in the place of origin and their niches. Method: We have tested this hypothesis on three lineages of SHED from varying donours. The SHED were isolated from the exfoliated deciduous teeth dental pulp using enzymatic dissociation and seeded onto cultivation dishes containing the test medium of 2% of FCS. The cells were then continuously expanded over the Hayflick Limit, the proof of “stemness”. Following the proliferation potential test, we have examined the phenotype of the cultured undifferentiated cells which expressed high positivity of the Mesenchymal Stem Cell (MSC) surface markers, which agrees with the characteristic SHED phenotype. After we have audited the impact of the isolation and cultivation methods, we have proceeded to test their differentiation potential by seeding the cultured SHED into various differentiation media. The SHED have successfully differentiated into all the targeted unipotent tissue and cell types, namely: osteoblasts, chondrocytes, endothelocytes, myofibroblasts and neural cells. Results: Overall, our data shows that the SHED cultured in low-xenogeneic-serum medium, unlike the SHED cultured in high-xenogeneic-serum media, express lowered positivity of the same surface markers. Conclusion: Our results suggest that SHED are exceptionally promising and available mesenchymal stem cell population, especially applicable for neuroregenerative medicine. Keywords: stem cells from human exfoliated deciduous teeth – SHED – xenogeneic serum – fetal calf serum, 2% FCS – enzymatic digestion – differentiation potential

Stomatologická klinika LF UK a FN Hradec Králové

Ústav histologie a embryologie LF UK Hradec Králové

In vitro cultivation of dental pulp stem cells from human exfoliated deciduous teeth in low-xenogeneic-serum containing media (original article – experimental study)