Úvod a cíl práce: Kmenové buňky zubní dřeně (KBZD) vykazují přirozeně vysokou pozitivitu na povrchový receptor glykoprotein CD44 podílející se mimo jiné na indukci mineralizace odontoblastů, přičemž kyselina hyaluronová (KH) je jeho hlavní ligandou. Cílem experimentu bylo posoudit vliv KH o nízké (NMH-KH), střední (SHM-KH) a vysoké (VMH-KH) molekulární hmotnosti na fenotypový profil, proliferační aktivitu a diferenciační potenciál lidských KBZD. Metodika: Experiment byl proveden v in vitro podmínkách na dvou liniích lidských KBZD odlišných dárců (třetí molár – muž, 25 let, a první premolár – muž, 9 let). Tyto linie byly kultivovány ve standardním médiu a od druhé pasáže také ve třech experimentálních kultivačních médiích obsahujících 0,1 % kyseliny hyaluronové (KH) ve třech molekulárních hmotnostech: NMH-KH (116 kDa), SHM-KH (540 kDa) a VHM-KH (1500 kDa). Analýza fenotypu byla provedena v sedmé pasáži pomocí průtokového cytometru Vi-Cell XR, viabilita byla měřena analyzátorem Vi-Cell v sedmé pasáži a počet buněk analyzátorem Z2 Coulter ve všech pasážích. Osteodiferenciace a chondrodiferenciace byly indukovány komerčně dodávanými diferenciačními médii a prokazovány histologickým barvením s alciánovou modří a alizarinovou červení. Výsledky: Linie KBZD využité v našem experimentu vykazovaly fenotyp typický pro lidské KBZD (vysoká pozitivita pro CD 13, CD 29, CD 44, CD 90 a OCT3/4), byly schopny překročit Hayflickův limit a diferencovat v buňky produkující osteogenní a chondrogenní extracelulární matrix. Během experimentu dosáhly KBZD linie 1 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) v tomto pořadí celkem 14,1 / 15,3 / 15,4 / 14,8 populačních zdvojení. Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 31,6 (29,2; 36,8) / 29,6 (28,5; 30,6) / 30,3 (26,7; 31,3) / 30,5 (29,7; 33,8) hodin. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 92,3 / 93,1 / 91,8 / 92,6 %. KBZD linie 2 kultivované v kontrolním médiu / médiu 1 (116 kDa KH) / médiu 2 (540 kDa KH) / médiu 3 (1500 kDa KH) dosáhly v tomto pořadí celkem 16,7 / 17,2 / 16,7 / 16,8 populačních zdvojení. Medián doubling time s minimální a maximální hodnotou ve stejném pořadí byl 28,9 (24,5; 35,2) / 27,4 (24,5; 32,6) / 28,3 (24,0; 38,4) / 27,1 (25,3; 33,9) hodin. Viabilita KBZD získaných ze sedmé pasáže byla ve stejném pořadí 80,1 / 82,5 / 81,8 / 80,9 %. Závěr: Ověřili jsme, že KBZD v přítomnosti kyseliny hyaluronové o molekulárních hmotnostech 116, 540 a 1500 kDa v koncentraci 0,1 % přežívají, proliferují a udržují si schopnost diferencovat ve zralé buněčné elementy. Dále jsme ověřili původní předpoklad, že nízkomolekulární forma kyseliny hyaluronové bude mít rozdílný dopad na fenotyp KBZD než forma vysokomolekulární.

Introduction: Dental pulp stem cells (DPSCs) express naturally high positivity for surface receptor glycoprotein CD 44 which is involved in the induction of odontoblast mineralization with hyaluronic acid (HA) being its major ligand. The aim of this experiment was to assess the effect of HA in low (LMW-HA), medium (MMW-HA) and high (HMW-HA) molecular weights on the phenotypic profile, proliferation activity and differentiation potential of human DPSCs. Methods: The experiment was conducted in vitro on two lines of human DPSCs from different donors (third molar – male, 25 years and first premolar – male, 9 years). These lines were cultured in standard medium and from the second passage also in three experimental culture media containing 0.1% HA in three molecular weights: LMW-HA (116 kDa), MMW-HA (540 kDa) and HMW-HA (1500 kDa). The phenotypic analysis was performed in the seventh passage using a Vi-Cell XR flow cytometer, viability was evaluated by the Vi-Cell Analyzer in the seventh passage and proliferation activity measured by the Z2 Counter Analyzer in every passage. Osteo- and chondro- differentiation were inducted by commercially supplied cultivation media and demonstrated by histological staining with alcian blue and alizarin red. Results: DPSCs used in our experiment expressed phenotype typical for human DPSCs (high positivity for CD 13, CD 29, CD 44, CD 90 and OCT 3/4), they were able to exceed Hayflick limit and differentiate in the osteogenic as well as the chondrogenic extracellular matrix. During the experiment, DPSCs line 1 cultivated in control medium / medium 1 (116 kDa HA) / medium 2 (540 kDa HA) / medium 3 (1500 kDa HA) achieved in this order in total 14.1/15.3/15.4/14.8 population doublings. The median of doubling time with the minimal and maximal values in the same order was 31.6 (29.2; 36.8) / 29.6 (28.5; 30.6) / 30.3 (26.7; 31.3) / 30.5 (29.7; 33.8) hours. The viability of the DPSCs obtained from the seventh passage was in the same order 92.3/93.1/91.8/92.6%. DPSC line 2 cultivated in control medium / medium 1 (116 kDa HA) / medium 2 (540 kDa HA) / medium 3 (1500 kDa HA) achieved in this order in total 16.7/17.2/16.7/16.8 population doublings. The median of doubling time with the minimal and maximal values in the same order was 28.9 (24.5; 35.2) / 27.4 (24.5; 32.6) / 28.3 (24.0; 38.4) / 27.1 (25.3; 33.9) hours. The viability of the DPSCs obtained from the seventh passage was in the same order 80.1/82.5/81.8/80.9%. Conclusion: We verified that DPSCs in the presence of hyaluronic acid at a concentration of 0.1% and molecular weights of 116, 540 and 1500 kDa survive, proliferate and maintain the ability to differentiate in mature cellular elements. We also verified the original assumption that the low molecular weight form of hyaluronic acid has a different impact on the DPSCs‘ phenotype than the high molecular weight form of hyaluronic acid.

• MeSH
• kyselina hyaluronová * MeSH
• lidé MeSH
• výzkum kmenových buněk * MeSH
• zubní dřeň MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

The aim of this study was to extensively characterise natal dental pulp stem cells (nDPSC) and assess their efficiency to generate human induced pluripotent stem cells (hiPSC). A number of distinguishing features prompted us to choose nDPSC over normal adult DPSC, in that they differed in cell surface marker expression and initial doubling time. In addition, nDPSC expressed 17 out of 52 pluripotency genes we analysed, and the level of expression was comparable to human embryonic stem cells (hESC). Ours is the first group to report comprehensive characterization of nDPSC followed by directed reprogramming to a pluripotent stem cell state. nDPSC yielded hiPSC colonies upon transduction with Sendai virus expressing the pluripotency transcription factors POU5F1, SOX2, c-MYC and KLF4. nDPSC had higher reprogramming efficiency compared to human fibroblasts. nDPSC derived hiPSCs closely resembled hESC in terms of their morphology, expression of pluripotency markers and gene expression profiles. Furthermore, nDPSC derived hiPSCs differentiated into the three germ layers when cultured as embryoid bodies (EB) and by directed differentiation. Based on our findings, nDPSC present a unique marker expression profile compared with adult DPSC and possess higher reprogramming efficiency as compared with dermal fibroblasts thus proving to be more amenable for reprogramming.

• MeSH
• biologické markery MeSH
• buněčná diferenciace genetika   MeSH
• embryoidní tělíska cytologie   MeSH
• fibroblasty cytologie   metabolismus   MeSH
• indukované pluripotentní kmenové buňky cytologie   metabolismus   MeSH
• karyotyp MeSH
• kmenové buňky cytologie   metabolismus   MeSH
• kultivované buňky MeSH
• lidé MeSH
• předmléčné zuby cytologie   MeSH
• přeprogramování buněk * MeSH
• transkriptom MeSH
• vývojová regulace genové exprese MeSH
• zubní dřeň cytologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Tento projekt se zabývá reprogramováním somatických buněk na buňky pluripotentní pomocí indukce microRNA. Celkem budou miRNA transfekovány 3 buněčné linie. Úspěšnost indukce bude hodnocena pomocí reportérového genu spojeného s pluripotentním promotorem.Pluripotence bude hodnocena také pomocí microarrays. Čistá populace pluripotentích buněk bude izolována pomací FACS. Nervová diferenciace bude prováděna pomocí standardizovaného protokolu.; This project concerns reprogramming somatic cells into pluripotent cells by micro RNA induction. Three cell lines will be transfected with miRNA. The success in reprogramming will be validated by reporter gene driven by pluripotent marker and by next validation of pluripotency will be done by microarrays. Neural differentiation will be performed according to standardized protocol.

• MeSH
• buněčná diferenciace MeSH
• embryonální kmenové buňky MeSH
• fibroblasty MeSH
• indukované pluripotentní kmenové buňky MeSH
• mikro RNA MeSH
• neurony MeSH
• průtoková cytometrie metody   využití   MeSH
• zubní dřeň MeSH

• Konspekt
• Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
• NLK Obory
• neurologie
• biologie
• cytologie, klinická cytologie
• NLK Publikační typ
• závěrečné zprávy o řešení grantu IGA MZ ČR