Východiska: Rezistence nádorových buněk k cytostatikům je způsobena řadou mechanizmů, které se často kombinují. Patří k nim redukovaný vstup cytostatika do buňky nebo jeho zvýšený eflux, zvýšená oprava DNA, defekty apoptotických drah, zvýšené odbourávání cytostatika a také zvýšená hladina intracelulárních thiolů glutathionu a metalothioneinů (MT). Bylo popsáno, že vysoká koncentrace thiolových skupin v cytoplazmě váže platinové alkylační deriváty a chemorezistence je způsobena přenosem platiny z cytostatika na MT, které je inaktivují. Protože jsme v našich předchozích studiích prokázali zvýšení hladin MT v rezistentních neuroblastomových (NB) liniích, ale ne v senzitivních liniích po inkubaci s platinovými cytostatiky, zabývali jsme se významem MT-3 pro buňky NB. Metoda: Buňky NB linie SiMa transfekované vektorem obsahujícím lidský MT-3 a GFP nebo pouze GFP (kontrola). Expresní microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides s 1 609 DNA probami (Custom Array, Bothell, WA, USA), exprese MT-3 a nejvíce exprimovaných genů validována real-time polymerázová řetězová reakce (RT-PCR). Citlivost k CDDP (cisplatina) – MTT test, vyšetření klonogenicity, průkaz štěpení kaspázy 3 Western blottem a volné kyslíkové radikály fluorescenční mikroskopií po barvení CellROX Deep Red Reagent. Hladiny mRNA MT-3 ve 23 vzorcích vysoce rizikových NB buňkách normální lidské kůry nadledviny a bovinní nadledviny byly vyšetřeny RT-PCR. Výsledky: Expresní microarray prokázala downregulaci 3 a over-expresi 19 genů u MT-3 transfekovaných NB buněk. Pomocí genové ontologie bylo zjištěno, že over-exprimované geny řídí onkogeny indukovanou senescenci (CDKN2B a ANAPC5), a zvýšeně exprimované byly i geny glutathion S-transferázy M3, kaspázy 4 a DNAJB6 (chaperon neuronálních proteinů). Prokázali jsme sníženou senzitivitu MT-3 transfekovaných buněk k CDDP (24 h IC50 7,48 ± 0,97 a 19,81 ± 1,2 µg/ml), vyšší počet kolonií po inkubaci s CDDP, snížené štěpení kaspázy 3 po inkubaci s CDDP a nižší volné kyslíkové radikály po jejich indukci CDDP. Buňky vysoce rizikových NB exprimovaly MT-3 významně více než nenádorové buňky nadledviny, ale nepodařilo se prokázat jednoznačný vztah k průběhu onemocnění. Závěr: Prokázali jsme vztah mezi MT-3 a geny onkogeny indukované senescence a některými dalšími geny významnými pro osud buňky (glutathion S-transferáza M3, kaspáza 4 a DNAJB6) a významný podíl MT-3 na rezistenci k CDDP. Vysoké hladiny MT-3 u vysoce rizikového NB by mohly být jednou z příčin častých recidiv u tohoto nádoru.

Background: Resistance of cancer cells to cytostatics is caused by a number of mechanisms that are often combined. These include reduced cell entry or increased efflux, increased DNA repair, defects of, apoptotic pathways, increased cytostatic degradation as well as elevated levels of intracellular thiols of glutathione and metallothioneins (MT). It has been reported that high concentrations of thiol groups in the cytoplasm bind platinum alkylation derivatives and chemorezistence is due to the transfer of platinum from the cytostatic to MT, which inactivates them. Because we have shown an increase in MT levels in resistant neuroblastoma (NB) lines, but not in sensitive lines after incubation with platinum cytostatics, we have considered MT-3 for NB cells in our previous studies. Method: SiMa NB cell lines transfected with vector containing human MT-3 and GFP or GFP only (control). Expression Microarray Human Cancer 3711 ElectraSense medium density 4 × 2k array slides with 1,609 DNA probes (Custom Array, Bothell, WA, USA), MT-3 expression and most expressed genes validated by real-time polymerase chain reaction. Sensitivity to CDDP (cisplatin) – MTT assay, clonogenicity test, Western blott caspase cleavage and free oxygen radicals fluorescence microscopy after CellROX Deep Red Reagent staining. Levels of MT-3 mRNA in 23 samples of high-risk NB, normal human cortex and bovine adrenal glands were investigated by reverse transcription polymerase chain reaction. Results: Expression microarray showed downregulation 3 and overexpression of 19 genes in MT-3 transfected NB cells. Using gene ontology, over-expressed genes have been shown to drive senescence-induced oncogenes (CDKN2B and ANAPC5), and the genes of glutathione S-transferase M3, caspase 4 and DNAJB6 (chaperone neuronal proteins) were also expressed. We have demonstrated a reduced sensitivity of MT-3 transfected cells to CDDP (24h IC50 of 7.48 ? 0.97 and 19.81 ? 1.2 μg/ml), a higher number of colonies after incubation with CDDP, reduced caspase 3 after incubation with CDDP and lower free oxygen radicals after induction of CDDP. High-grade NB cells expressed MT-3 significantly more than non-tumoral adrenal cells but failed to show a clear relationship to disease course. Conclusion: We have demonstrated the relationship between MT-3 and senescence-induced oncogene genes and some other genes relevant to cell fate (glutathione S-transferase M3, caspase 4 and DNAJB6) and a significant proportion of MT-3 on CDDP resistance. High levels of MT-3 in high-risk NB could be one of the causes of frequent relapses in this tumor.

Centrum molekulární medicíny CEITEC Středoevropský technologický institut MU Brno

Klinika dětské hematologie a onkologie 2 LF UK a FN Motol Praha

Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta Mendelovy univerzity v Brně

Identifying the importance of MT-3 expression for neuroblastoma cells