Cílem studie bylo otestovat použitelnost metody PCR v kombinaci s High Resolution Melting Analysis (HRMA) pro detekci a identifikaci dermatofytů přímo z klinických vzorků kůže a jejích adnex. Metodika by měla vést ke zrychlení a zvýšení výtěžnosti diagnostiky dermatomykóz a ke zkvalitnění péče o pacienta. Ve studii bylo analyzováno 128 klinických vzorků od pacientů s podezřením na dermatomykózu. Pro izolaci DNA dermatofytů z klinického materiálu byl použit izolační KIT ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM. Pro detekci DNA oblastí kódujících ribozomální RNA byly využity dvě sady primerů zachycující široké spektrum dermatofytů. Pro druhovou identifikaci dermatofytů byla použita real-time PCR metoda v kombinaci s High Resolution Melting Analysis (PCR-HRMA). Dermatofytóza byla potvrzena u 42 ze 128 zkoumaných vzorků (pozitivní přímá mikroskopie, kultivace, detekce PCR-HRMA, nebo kombinace metod). Výtěžnost PCR detekce byla 74 % pro obě sady primerů, metoda HRMA umožnila ve všech případech druhovou identifikaci detekovaných dermatofytů pomocí PCR. Naproti tomu kultivace byla pozitivní pouze u 52 % pacientů s dermatofytózou. Mikroskopie ze vzorku byla pozitivní v 90 % pozitivních dermatofytóz. Při současném použití mikroskopie, kultivace a PCR-HRMA bylo úspěšně identifikováno na úroveň druhu 90 % dermatofytů. Nejčastější druhy dermatofytů (Trichophyton rubrum, T. interdigitale, T. benhamiae) byly touto metodikou spolehlivě zachyceny. PCR detekce rDNA přímo z klinického materiálu s využitím HRMA zvýšila výtěžnost diagnostiky dermatofytóz zvláště tím, že přispěla k dosažení druhové identifikace u výrazně vyššího počtu případů v porovnání s konvenčními metodami. Kombinace konvenčních a molekulárně biologických vyšetření se zdá být vhodná pro rychlou a spolehlivou diagnostiku dermatofytóz bez nutnosti výrazného navýšení nákladů.

The aim of the study was to test the utility of the PCR method in combination with High Resolution Melting Analysis (HRMA) for the detection and identification of dermatophytes directly from clinical skin and adnexa samples. The methodology should reduce the time between sampling and diagnosis, increase the diagnostic sensitivity, and overall improve patient care. In the study, 128 clinical samples from patients with suspected dermatomycosis were analyzed. To isolate fungal DNA from the clinical specimens, a KIT ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM was used. Two sets of primers specific for a wide range of dermatophytes were used to detect ribosomal DNA regions. The real-time PCR High Resolution Melting Analysis (PCR-HRMA) method was used for dermatophyte species identification. The PCR detection success was 74% for both sets of primers, the PCR-HRMA method enabled dermatophyte species identification in all PCR positive cases. In contrast, only 52% of patients with dermatophytosis were culture positive. Microscopy from the sample was positive in 90% of patients with proven dermatophytosis. 90% of dermatophytes were successfully identified using microscopy, culture and PCR-HRMA. The most common dermatophyte species (Trichophyton rubrum, T. interdigitale, T. benhamiae) were reliably detected by this methodology. PCR detection of rDNA directly from clinical material using HRMA increased the number of species identificacions in the diagnosis of dermatophytosis. The combination of classical and molecular biologic examinations appears to be a suitable method for the rapid and reliable diagnosis of dermatophytosis.

Oddělení bakteriologie a mykologie Centrum klinických laboratoří Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě

Oddělení molekulární biologie Centrum klinických laboratoří Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě

Ústav mikrobiologie Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

Use of PCR-HRMA for direct detection and identification of dermatophytosis agents from clinical samples