Helicobacter pylori infection is a major risk factor for the development of gastric cancer. The bacteria reside in close proximity to gastric surface mucous as well as stem and progenitor cells. Here, we take advantage of wild-type and genetically engineered murine gastric organoids and organoid-derived monolayers to study the cellular targets of H. pylori-induced DNA damage and replication stress and to explore possible interactions with preexisting gastric cancer driver mutations. We find using alkaline comet assay, single-molecule DNA fiber assays, and immunofluorescence microscopy of DNA repair foci that H. pylori induces transcription-dependent DNA damage in actively replicating, Leucine-rich-repeat containing G-Protein-Coupled Receptor 5 (Lgr5)-positive antral stem and progenitor cells and their Troy-positive corpus counterparts, but not in other gastric epithelial lineages. Infection-dependent DNA damage is aggravated by Apc inactivation, but not by Trp53 or Smad4 loss, or Erbb2 overexpression. Our data suggest that H. pylori induces DNA damage in stem and progenitor cells, especially in settings of hyperproliferation due to constitutively active Wnt signaling.

Comprehensive Cancer Center Zürich Zürich Switzerland

Department of Molecular Life Sciences University of Zürich Zürich Switzerland

Functional Genomics Center Zürich University of Zürich ETHZ Zürich Switzerland

Institute of Molecular Cancer Research University of Zürich Zürich Switzerland

Laboratory of Cell and Developmental Biology Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences Prague Czech Republic

Zobrazit více v PubMed

M. Amieva, R. M. Peek Jr., Pathobiology of Helicobacter pylori-induced gastric cancer. Gastroenterology 150, 64–78 (2016). PubMed PMC

U. Dutta, P. K. Garg, R. Kumar, R. K. Tandon, Typhoid carriers among patients with gallstones are at increased risk for carcinoma of the gallbladder. Am. J. Gastroenterol. 95, 784–787 (2000). PubMed

V. Nagaraja, G. D. Eslick, Systematic review with meta-analysis: The relationship between chronic Salmonella typhi carrier status and gall-bladder cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. 39, 745–750 (2014). PubMed

L. Mughini-Gras, M. Schaapveld, J. Kramers, S. Mooij, E. A. Neefjes-Borst, W. v. Pelt, J. Neefjes, Increased colon cancer risk after severe Salmonella infection. PLOS ONE 13, e0189721 (2018). PubMed PMC

J. C. Arthur, E. Perez-Chanona, M. Mühlbauer, S. Tomkovich, J. M. Uronis, T. J. Fan, B. J. Campbell, T. Abujamel, B. Dogan, A. B. Rogers, J. M. Rhodes, A. Stintzi, K. W. Simpson, J. J. Hansen, T. O. Keku, A. A. Fodor, C. Jobin, Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science 338, 120–123 (2012). PubMed PMC

P. J. Dziubanska-Kusibab, H. Berger, F. Battistini, B. A. M. Bouwman, A. Iftekhar, R. Katainen, T. Cajuso, N. Crosetto, M. Orozco, L. A. Aaltonen, T. F. Meyer, Colibactin DNA-damage signature indicates mutational impact in colorectal cancer. Nat. Med. 26, 1063–1069 (2020). PubMed

C. Pleguezuelos-Manzano, J. Puschhof, A. Rosendahl Huber, A. van Hoeck, H. M. Wood, J. Nomburg, C. Gurjao, F. Manders, G. Dalmasso, P. B. Stege, F. L. Paganelli, M. H. Geurts, J. Beumer, T. Mizutani, Y. Miao, R. van der Linden, S. van der Elst, J. C. Ambrose, P. Arumugam, E. L. Baple, M. Bleda, F. Boardman-Pretty, J. M. Boissiere, C. R. Boustred, H. Brittain, M. J. Caulfield, G. C. Chan, C. E. H. Craig, L. C. Daugherty, A. de Burca, A. Devereau, G. Elgar, R. E. Foulger, T. Fowler, P. Furió-Tarí, J. M. Hackett, D. Halai, A. Hamblin, S. Henderson, J. E. Holman, T. J. P. Hubbard, K. Ibáñez, R. Jackson, L. J. Jones, D. Kasperaviciute, M. Kayikci, L. Lahnstein, L. Lawson, S. E. A. Leigh, I. U. S. Leong, F. J. Lopez, F. Maleady-Crowe, J. Mason, E. M. McDonagh, L. Moutsianas, M. Mueller, N. Murugaesu, A. C. Need, C. A. Odhams, C. Patch, D. Perez-Gil, D. Polychronopoulos, J. Pullinger, T. Rahim, A. Rendon, P. Riesgo-Ferreiro, T. Rogers, M. Ryten, K. Savage, K. Sawant, R. H. Scott, A. Siddiq, A. Sieghart, D. Smedley, K. R. Smith, A. Sosinsky, W. Spooner, H. E. Stevens, A. Stuckey, R. Sultana, E. R. A. Thomas, S. R. Thompson, C. Tregidgo, A. Tucci, E. Walsh, S. A. Watters, M. J. Welland, E. Williams, K. Witkowska, S. M. Wood, M. Zarowiecki, K. C. Garcia, J. Top, R. J. L. Willems, M. Giannakis, R. Bonnet, P. Quirke, M. Meyerson, E. Cuppen, R. van Boxtel, H. Clevers; Genomics England Research Consortium , Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks+ E. coli. Nature 580, 269–273 (2020). PubMed PMC

A. E. M. Ibler, M. ElGhazaly, K. L. Naylor, N. A. Bulgakova, S. F. el-Khamisy, D. Humphreys, Typhoid toxin exhausts the RPA response to DNA replication stress driving senescence and Salmonella infection. Nat. Commun. 10, 4040 (2019). PubMed PMC

O. C. B. Martin, A. Bergonzini, M. Lopez Chiloeches, E. Paparouna, D. Butter, S. D. P. Theodorou, M. M. Haykal, E. Boutet-Robinet, T. Tebaldi, A. Wakeham, M. Rhen, V. G. Gorgoulis, T. Mak, I. S. Pateras, T. Frisan, Influence of the microenvironment on modulation of the host response by typhoid toxin. Cell Rep. 35, 108931 (2021). PubMed

M. Bauer, Z. Nascakova, A. I. Mihai, P. F. Cheng, M. P. Levesque, S. Lampart, R. Hurwitz, L. Pfannkuch, J. Dobrovolna, M. Jacobs, S. Bartfeld, A. Dohlman, X. Shen, A. A. Gall, N. R. Salama, A. Töpfer, A. Weber, T. F. Meyer, P. Janscak, A. Müller, The ALPK1/TIFA/NF-κB axis links a bacterial carcinogen to R-loop-induced replication stress. Nat. Commun. 11, 5117 (2020). PubMed PMC

C. Chumduri, R. K. Gurumurthy, P. K. Zadora, Y. Mi, T. F. Meyer, Chlamydia infection promotes host DNA damage and proliferation but impairs the DNA damage response. Cell Host Microbe 13, 746–758 (2013). PubMed

M. Plummer, S. Franceschi, J. Vignat, D. Forman, C. de Martel, Global burden of gastric cancer attributable to Helicobacter pylori. Int. J. Cancer 136, 487–490 (2015). PubMed

F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre, A. Jemal, Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 68, 394–424 (2018). PubMed

J. Parsonnet, G. D. Friedman, D. P. Vandersteen, Y. Chang, J. H. Vogelman, N. Orentreich, R. K. Sibley, Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N. Engl. J. Med. 325, 1127–1131 (1991). PubMed

J. Parsonnet, D. Vandersteen, J. Goates, R. K. Sibley, J. Pritikin, Y. Chang, Helicobacter pylori infection in intestinal- and diffuse-type gastric adenocarcinomas. J. Natl. Cancer Inst. 83, 640–643 (1991). PubMed

T. Rokkas, A. Rokka, P. Portincasa, A systematic review and meta-analysis of the role of Helicobacter pylori eradication in preventing gastric cancer. Ann. Gastroenterol. 30, 414–423 (2017). PubMed PMC

I. J. Choi, M. C. Kook, Y. I. Kim, S. J. Cho, J. Y. Lee, C. G. Kim, B. Park, B. H. Nam, Helicobacter pylori therapy for the prevention of metachronous gastric cancer. N. Engl. J. Med. 378, 1085–1095 (2018). PubMed

I. J. Choi, Y. I. Kim, B. Park, Helicobacter pylori and prevention of gastric cancer. N. Engl. J. Med. 378, 2244–2245 (2018). PubMed

S. Backert, R. Haas, M. Gerhard, M. Naumann, The Helicobacter pylori type IV secretion system encoded by the cag pathogenicity island: Architecture, function, and signaling. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 413, 187–220 (2017). PubMed

J. Q. Huang, G. F. Zheng, K. Sumanac, E. J. Irvine, R. H. Hunt, Meta-analysis of the relationship between cagA seropositivity and gastric cancer. Gastroenterology 125, 1636–1644 (2003). PubMed

S. Zimmermann, L. Pfannkuch, M. A. al-Zeer, S. Bartfeld, M. Koch, J. Liu, C. Rechner, M. Soerensen, O. Sokolova, A. Zamyatina, P. Kosma, A. P. Mäurer, F. Glowinski, K. P. Pleissner, M. Schmid, V. Brinkmann, A. Karlas, M. Naumann, M. Rother, N. Machuy, T. F. Meyer, ALPK1- and TIFA-dependent innate immune response triggered by the Helicobacter pylori type IV secretion system. Cell Rep. 20, 2384–2395 (2017). PubMed

A. Gall, R. G. Gaudet, S. D. Gray-Owen, N. R. Salama, TIFA signaling in gastric epithelial cells initiates the cag type 4 secretion system-dependent innate immune response to Helicobacter pylori infection. mBio 8, e01168-17 (2017). PubMed PMC

S. C. Stein, E. Faber, S. H. Bats, T. Murillo, Y. Speidel, N. Coombs, C. Josenhans, Helicobacter pylori modulates host cell responses by CagT4SS-dependent translocation of an intermediate metabolite of LPS inner core heptose biosynthesis. PLOS Pathog. 13, e1006514 (2017). PubMed PMC

P. Zhou, Y. She, N. Dong, P. Li, H. He, A. Borio, Q. Wu, S. Lu, X. Ding, Y. Cao, Y. Xu, W. Gao, M. Dong, J. Ding, D. C. Wang, A. Zamyatina, F. Shao, Alpha-kinase 1 is a cytosolic innate immune receptor for bacterial ADP-heptose. Nature 561, 122–126 (2018). PubMed

S. Imai, T. Ooki, N. Murata-Kamiya, D. Komura, K. Tahmina, W. Wu, A. Takahashi-Kanemitsu, C. T. Knight, A. Kunita, N. Suzuki, A. A. del Valle, M. Tsuboi, M. Hata, Y. Hayakawa, N. Ohnishi, K. Ueda, M. Fukayama, T. Ushiku, S. Ishikawa, M. Hatakeyama, Helicobacter pylori CagA elicits BRCAness to induce genome instability that may underlie bacterial gastric carcinogenesis. Cell Host Microbe 29, 941–958.e10 (2021). PubMed

Y. Usui, Y. Taniyama, M. Endo, Y. N. Koyanagi, Y. Kasugai, I. Oze, H. Ito, I. Imoto, T. Tanaka, M. Tajika, Y. Niwa, Y. Iwasaki, T. Aoi, N. Hakozaki, S. Takata, K. Suzuki, C. Terao, M. Hatakeyama, M. Hirata, K. Sugano, T. Yoshida, Y. Kamatani, H. Nakagawa, K. Matsuda, Y. Murakami, A. B. Spurdle, K. Matsuo, Y. Momozawa, Helicobacter pylori, homologous-recombination genes, and gastric cancer. N. Engl. J. Med. 388, 1181–1190 (2023). PubMed

C. Aguilar, M. Pauzuolis, M. Pompaiah, E. Vafadarnejad, P. Arampatzi, M. Fischer, D. Narres, M. Neyazi, Ö. Kayisoglu, T. Sell, N. Blüthgen, M. Morkel, A. Wiegering, C. T. Germer, S. Kircher, A. Rosenwald, A. E. Saliba, S. Bartfeld, Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nat. Commun. 13, 5878 (2022). PubMed PMC

G. A. Busslinger, B. L. A. Weusten, A. Bogte, H. Begthel, L. A. A. Brosens, H. Clevers, Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34, 108819 (2021). PubMed

A. E. Moor, Y. Harnik, S. Ben-Moshe, E. E. Massasa, M. Rozenberg, R. Eilam, K. Bahar Halpern, S. Itzkovitz, Spatial reconstruction of single enterocytes uncovers broad zonation along the intestinal villus axis. Cell 175, 1156–1167.e15 (2018). PubMed

S. Han, J. Fink, D. J. Jörg, E. Lee, M. K. Yum, L. Chatzeli, S. R. Merker, M. Josserand, T. Trendafilova, A. Andersson-Rolf, C. Dabrowska, H. Kim, R. Naumann, J. H. Lee, N. Sasaki, R. L. Mort, O. Basak, H. Clevers, D. E. Stange, A. Philpott, J. K. Kim, B. D. Simons, B. K. Koo, Defining the identity and dynamics of adult gastric isthmus stem cells. Cell Stem Cell 25, 342–356.e7 (2019). PubMed PMC

X. Han, R. Wang, Y. Zhou, L. Fei, H. Sun, S. Lai, A. Saadatpour, Z. Zhou, H. Chen, F. Ye, D. Huang, Y. Xu, W. Huang, M. Jiang, X. Jiang, J. Mao, Y. Chen, C. Lu, J. Xie, Q. Fang, Y. Wang, R. Yue, T. Li, H. Huang, S. H. Orkin, G. C. Yuan, M. Chen, G. Guo, Mapping the mouse cell atlas by microwell-seq. Cell 172, 1091–1107.e17 (2018). PubMed

T. L. Cover, D. B. Lacy, M. D. Ohi, The Helicobacter pylori Cag type IV secretion system. Trends Microbiol. 28, 682–695 (2020). PubMed PMC

I. C. Arnold, X. Zhang, S. Urban, M. Artola-Borán, M. G. Manz, K. M. Ottemann, A. Müller, NLRP3 controls the development of gastrointestinal CD11b+ dendritic cells in the steady state and during chronic bacterial infection. Cell Rep. 21, 3860–3872 (2017). PubMed

J. Reichmuth, J. vom Berg, M. Brügger, G. Hausmann, T. Valenta, K. Basler, Manipulating the murine Lgr5 locus using a rapid, efficient and flexible CRISPR/Cas9 pipeline. bioRxiv 2020.12.31.424946 [Preprint] (1 January 2021). 10.1101/2020.12.31.424946. DOI

H. Fazilaty, M. D. Brügger, T. Valenta, B. M. Szczerba, L. Berkova, N. Doumpas, G. Hausmann, M. Scharl, K. Basler, Tracing colonic embryonic transcriptional profiles and their reactivation upon intestinal damage. Cell Rep. 36, 109484 (2021). PubMed

Cancer Genome Atlas Research Network , Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature 513, 202–209 (2014). PubMed PMC

M. van de Wetering, E. Sancho, C. Verweij, W. de Lau, I. Oving, A. Hurlstone, K. van der Horn, E. Batlle, D. Coudreuse, A. P. Haramis, M. Tjon-Pon-Fong, P. Moerer, M. van den Born, G. Soete, S. Pals, M. Eilers, R. Medema, H. Clevers, The beta-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell 111, 241–250 (2002). PubMed

I. M. Toller, K. J. Neelsen, M. Steger, M. L. Hartung, M. O. Hottiger, M. Stucki, B. Kalali, M. Gerhard, A. A. Sartori, M. Lopes, A. Müller, Carcinogenic bacterial pathogen Helicobacter pylori triggers DNA double-strand breaks and a DNA damage response in its host cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14944–14949 (2011). PubMed PMC

M. L. Hartung, D. C. Gruber, K. N. Koch, L. Grüter, H. Rehrauer, N. Tegtmeyer, S. Backert, A. Müller, H. pylori -induced DNA strand breaks are introduced by nucleotide excision repair endonucleases and promote NF-κB target gene expression. Cell Rep. 13, 70–79 (2015). PubMed

D. E. Stange, B. K. Koo, M. Huch, G. Sibbel, O. Basak, A. Lyubimova, P. Kujala, S. Bartfeld, J. Koster, J. H. Geahlen, P. J. Peters, J. H. van Es, M. van de Wetering, J. C. Mills, H. Clevers, Differentiated Troy+ chief cells act as reserve stem cells to generate all lineages of the stomach epithelium. Cell 155, 357–368 (2013). PubMed PMC

M. Sigal, M. D. M. Reinés, S. Müllerke, C. Fischer, M. Kapalczynska, H. Berger, E. R. M. Bakker, H. J. Mollenkopf, M. E. Rothenberg, B. Wiedenmann, S. Sauer, T. F. Meyer, R-spondin-3 induces secretory, antimicrobial Lgr5+ cells in the stomach. Nat. Cell Biol. 21, 812–823 (2019). PubMed

M. A. Schumacher, E. Aihara, R. Feng, A. Engevik, N. F. Shroyer, K. M. Ottemann, R. T. Worrell, M. H. Montrose, R. A. Shivdasani, Y. Zavros, The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J. Physiol. 593, 1809–1827 (2015). PubMed PMC

A. Mueller, D. S. Merrell, J. Grimm, S. Falkow, Profiling of microdissected gastric epithelial cells reveals a cell type-specific response to Helicobacter pylori infection. Gastroenterology 127, 1446–1462 (2004). PubMed

G. R. Van den Brink, K. M. Tytgat, R. W. Van der Hulst, C. M. Van der Loos, A. W. Einerhand, H. A. Büller, J. Dekker, H. pylori colocalises with MUC5AC in the human stomach. Gut. 46, 601–607 (2000). PubMed PMC

M. Sigal, M. E. Rothenberg, C. Y. Logan, J. Y. Lee, R. W. Honaker, R. L. Cooper, B. Passarelli, M. Camorlinga, D. M. Bouley, G. Alvarez, R. Nusse, J. Torres, M. R. Amieva, Helicobacter pylori activates and expands Lgr5+ stem cells through direct colonization of the gastric glands. Gastroenterology 148, 1392–1404.e21 (2015). PubMed

D. Keilberg, Y. Zavros, B. Shepherd, N. R. Salama, K. M. Ottemann, Spatial and temporal shifts in bacterial biogeography and gland occupation during the development of a chronic infection. mBio 7, e01705 (2016). PubMed PMC

J. Wizenty, S. Müllerke, M. Kolesnichenko, J. Heuberger, M. Lin, A. S. Fischer, H. J. Mollenkopf, H. Berger, F. Tacke, M. Sigal, Gastric stem cells promote inflammation and gland remodeling in response to Helicobacter pylori via Rspo3-Lgr4 axis. EMBO J. 41, e109996 (2022). PubMed PMC

T. Uehara, D. Ma, Y. Yao, J. P. Lynch, K. Morales, A. Ziober, M. Feldman, H. Ota, A. R. Sepulveda, H. pylori infection is associated with DNA damage of Lgr5-positive epithelial stem cells in the stomach of patients with gastric cancer. Dig. Dis. Sci. 58, 140–149 (2013). PubMed PMC

M. Leushacke, S. H. Tan, A. Wong, Y. Swathi, A. Hajamohideen, L. T. Tan, J. Goh, E. Wong, S. L. I. J. Denil, K. Murakami, N. Barker, Lgr5-expressing chief cells drive epithelial regeneration and cancer in the oxyntic stomach. Nat. Cell Biol. 19, 774–786 (2017). PubMed

A. Fatehullah, Y. Terakado, S. Sagiraju, T. L. Tan, T. Sheng, S. H. Tan, K. Murakami, Y. Swathi, N. Ang, R. Rajarethinam, T. Ming, P. Tan, B. Lee, N. Barker, A tumour-resident Lgr5+ stem-cell-like pool drives the establishment and progression of advanced gastric cancers. Nat. Cell Biol. 23, 1299–1313 (2021). PubMed

T. Shimizu, H. Marusawa, Y. Matsumoto, T. Inuzuka, A. Ikeda, Y. Fujii, S. Minamiguchi, S.’. Miyamoto, T. Kou, Y. Sakai, J. E. Crabtree, T. Chiba, Accumulation of somatic mutations in TP53 in gastric epithelium with Helicobacter pylori infection. Gastroenterology 147, 407–17.e3 (2014). PubMed

T. Yoshida, T. Yamaguchi, S. Maekawa, S. Takano, T. Kuno, K. Tanaka, F. Iwamoto, Y. Tsukui, S. Kobayashi, Y. Asakawa, H. Shindo, M. Fukasawa, Y. Nakayama, T. Inoue, T. Uetake, M. Ohtaka, T. Sato, K. Mochizuki, N. Enomoto, Identification of early genetic changes in well-differentiated intramucosal gastric carcinoma by target deep sequencing. Gastric Cancer 22, 742–750 (2019). PubMed

M. V. Nemtsova, A. I. Kalinkin, E. B. Kuznetsova, I. V. Bure, E. A. Alekseeva, I. I. Bykov, T. V. Khorobrykh, D. S. Mikhaylenko, A. S. Tanas, S. I. Kutsev, D. V. Zaletaev, V. V. Strelnikov, Clinical relevance of somatic mutations in main driver genes detected in gastric cancer patients by next-generation DNA sequencing. Sci. Rep. 10, 504 (2020). PubMed PMC

N. Setia, J. W. Clark, D. G. Duda, T. S. Hong, E. L. Kwak, J. T. Mullen, G. Y. Lauwers, Familial gastric cancers. Oncologist 20, 1365–1377 (2015). PubMed PMC

S. Bartfeld, H. Clevers, Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. J. Vis. Exp. 12, 53359 (2015). PubMed PMC

A. Sayi, E. Kohler, I. Hitzler, I. Arnold, R. Schwendener, H. Rehrauer, A. Müller, The CD4+ T cell-mediated IFN-γ response to Helicobacter infection is essential for clearance and determines gastric cancer risk. J. Immunol. 182, 7085–7101 (2009). PubMed

S. Censini, C. Lange, Z. Xiang, J. E. Crabtree, P. Ghiara, M. Borodovsky, R. Rappuoli, A. Covacci, Cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14648–14653 (1996). PubMed PMC

I. C. Arnold, J. Y. Lee, M. R. Amieva, A. Roers, R. A. Flavell, T. Sparwasser, A. Müller, Tolerance rather than immunity protects from Helicobacter pylori-induced gastric preneoplasia. Gastroenterology 140, 199–209 (2011). PubMed PMC

J. Schindelin, I. Arganda-Carreras, E. Frise, V. Kaynig, M. Longair, T. Pietzsch, S. Preibisch, C. Rueden, S. Saalfeld, B. Schmid, J. Y. Tinevez, D. J. White, V. Hartenstein, K. Eliceiri, P. Tomancak, A. Cardona, Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods 9, 676–682 (2012). PubMed PMC

J. F. Dekkers, M. Alieva, L. M. Wellens, H. C. R. Ariese, P. R. Jamieson, A. M. Vonk, G. D. Amatngalim, H. Hu, K. C. Oost, H. J. G. Snippert, J. M. Beekman, E. J. Wehrens, J. E. Visvader, H. Clevers, A. C. Rios, High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat. Protoc. 14, 1756–1771 (2019). PubMed

A. De Magis, S. G. Manzo, M. Russo, J. Marinello, R. Morigi, O. Sordet, G. Capranico, DNA damage and genome instability by G-quadruplex ligands are mediated by R loops in human cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 116, 816–825 (2019). PubMed PMC

B. K. Koo, D. E. Stange, T. Sato, W. Karthaus, H. F. Farin, M. Huch, J. van Es, H. Clevers, Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nat. Methods 9, 81–83 (2011). PubMed

M. Hatakeyama, L. Opitz, G. Russo, W. Qi, R. Schlapbach, H. Rehrauer, SUSHI: An exquisite recipe for fully documented, reproducible and reusable NGS data analysis. BMC Bioinformatics 17, 228 (2016). PubMed PMC

A. Dobin, C. A. Davis, F. Schlesinger, J. Drenkow, C. Zaleski, S. Jha, P. Batut, M. Chaisson, T. R. Gingeras, STAR: Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29, 15–21 (2013). PubMed PMC

K. L. Howe, P. Achuthan, J. Allen, J. Allen, J. Alvarez-Jarreta, M. R. Amode, I. M. Armean, A. G. Azov, R. Bennett, J. Bhai, K. Billis, S. Boddu, M. Charkhchi, C. Cummins, L. da Rin Fioretto, C. Davidson, K. Dodiya, B. el Houdaigui, R. Fatima, A. Gall, C. Garcia Giron, T. Grego, C. Guijarro-Clarke, L. Haggerty, A. Hemrom, T. Hourlier, O. G. Izuogu, T. Juettemann, V. Kaikala, M. Kay, I. Lavidas, T. le, D. Lemos, J. Gonzalez Martinez, J. C. Marugán, T. Maurel, A. C. McMahon, S. Mohanan, B. Moore, M. Muffato, D. N. Oheh, D. Paraschas, A. Parker, A. Parton, I. Prosovetskaia, M. P. Sakthivel, A. I. A. Salam, B. M. Schmitt, H. Schuilenburg, D. Sheppard, E. Steed, M. Szpak, M. Szuba, K. Taylor, A. Thormann, G. Threadgold, B. Walts, A. Winterbottom, M. Chakiachvili, A. Chaubal, N. de Silva, B. Flint, A. Frankish, S. E. Hunt, G. R. IIsley, N. Langridge, J. E. Loveland, F. J. Martin, J. M. Mudge, J. Morales, E. Perry, M. Ruffier, J. Tate, D. Thybert, S. J. Trevanion, F. Cunningham, A. D. Yates, D. R. Zerbino, P. Flicek, Ensembl 2021. Nucleic Acids Res. 49, D884–D891 (2021). PubMed PMC

Y. Liao, G. K. Smyth, W. Shi, The subread aligner: Fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Res. 41, e108 (2013). PubMed PMC

M. I. Love, W. Huber, S. Anders, Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014). PubMed PMC

G. Yu, L. G. Wang, Y. Han, Q. Y. He, clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS 16, 284–287 (2012). PubMed PMC

A. Frankish, M. Diekhans, I. Jungreis, J. Lagarde, J. E. Loveland, J. M. Mudge, C. Sisu, J. C. Wright, J. Armstrong, I. Barnes, A. Berry, A. Bignell, C. Boix, S. Carbonell Sala, F. Cunningham, T. di Domenico, S. Donaldson, I. T. Fiddes, C. García Girón, J. M. Gonzalez, T. Grego, M. Hardy, T. Hourlier, K. L. Howe, T. Hunt, O. G. Izuogu, R. Johnson, F. J. Martin, L. Martínez, S. Mohanan, P. Muir, F. C. P. Navarro, A. Parker, B. Pei, F. Pozo, F. C. Riera, M. Ruffier, B. M. Schmitt, E. Stapleton, M. M. Suner, I. Sycheva, B. Uszczynska-Ratajczak, M. Y. Wolf, J. Xu, Y. T. Yang, A. Yates, D. Zerbino, Y. Zhang, J. S. Choudhary, M. Gerstein, R. Guigó, T. J. P. Hubbard, M. Kellis, B. Paten, M. L. Tress, P. Flicek, Gencode 2021. Nucleic Acids Res. 49, D916–D923 (2021). PubMed PMC

Y. Hao, S. Hao, E. Andersen-Nissen, W. M. Mauck III, S. Zheng, A. Butler, M. J. Lee, A. J. Wilk, C. Darby, M. Zager, P. Hoffman, M. Stoeckius, E. Papalexi, E. P. Mimitou, J. Jain, A. Srivastava, T. Stuart, L. M. Fleming, B. Yeung, A. J. Rogers, J. M. McElrath, C. A. Blish, R. Gottardo, P. Smibert, R. Satija, Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell 184, 3573–3587.e29 (2021). PubMed PMC