Východiska: Vývoj biofarmaceutik je nejrychleji se rozvíjející oblastí dnešního farmaceutického průmyslu. Analýza proteinových terapeutik je však velice náročný úkol kvůli jejich velikosti a komplexnosti prostorové struktury. Jakékoliv změny v primární, sekundární, terciální či kvarterní struktuře proteinů mohou mít výrazný vliv na jejich funkci, účinnost a v neposlední řadě i toxicitu. Hmotnostní spektrometrie se v minulosti osvědčila jako kvalitní nástroj pro analýzu primární struktury proteinů (aminokyselinové sekvence) a v posledních letech je díky rozvoji nových metod schopná analyzovat i vyšší proteinové struktury. Jednou z těchto nových metod je vodík/deuteriová výměna (HDX). HDX je založena na výměně amidových vodíků aminokyselinového řetězce za deuteria z okolního roztoku. Vodíky nacházející se na povrchu proteinu jsou za deuteria vyměňovány mnohem rychleji než vodíky schované uvnitř proteinu. Získané výsledky z HDX metody mohou poskytnout informace o prostorové struktuře proteinu a také o protein-proteinových a protein-ligandových interakcí. Navíc analýzou výměny deuterií v různých časových intervalech může tato metoda poskytnout informace i o dynamických změnách proteinové struktury a dynamice proteinových interakcí. Vzhledem k možnostem, které tato metoda nabízí, se HDX stala atraktivní metodou pro charakterizaci proteinových biofarmaceutik. Cíl: Cílem tohoto přehledového článku je poukázat na možnosti využití hmotnostní spektrometrie v biofarmaceutickém průmyslu se zaměřením na metodu HDX a její aplikace.
Background: The development of biopharmaceutics is the fastest growing segment of the present pharmaceutical industry. The analysis of proteins therapeutics is a challenging task due to their large size and complexity of spatial structure. Any changes in the primary, secondary, tertiary or quaternary protein structure can have huge impact on their function, efficiency and toxicity. Mass spectrometry proved itself to be a powerful tool for analysis of primary protein structure (amino acid sequence) and thanks to the development of new techniques in last years it is able to analyse higher order protein structures. One of these new techniques is hydrogen/deuterium exchange (HDX). HDX is based on exchange of amid protons with deuterium from solution on the protein backbone chain. Protons on the surface of protein are exchanging with deuterium much faster than protons buried inside of protein. HDX results could provide information about spatial protein structure and also about protein-protein interactions and protein-ligand interactions. Furthermore, by analysing of deuterium exchange in different time points this method could give information about dynamic changes of protein structure and dynamics of proteins interactions. Because of possibilities of this method, HDX become attractive method for characterization of protein biopharmaceuticals. Aims: This review article is focused on the utilization of mass spectrometry in biopharmaceutical industry and mainly on HDX method and its applications.
- Klíčová slova
- vodík/deuteriová výměna,
- MeSH
- farmaceutický průmysl MeSH
- hmotnostní spektrometrie metody využití MeSH
- konformace proteinů MeSH
- krystalografie rentgenová využití MeSH
- lidé MeSH
- mapování epitopu metody využití MeSH
- objevování léků metody MeSH
- proteiny analýza terapeutické užití MeSH
- proteomika metody MeSH
- translační modifikace proteinu MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Východiska: K léčbě onkologických onemocnění se používají kombinace postupů založených nejčastěji na chirurgickém odstranění nádoru, radioterapii, chemoterapii či hormonální terapii, přičemž samotný chirurgický zákrok většinou představuje stěžejní krok pro odstranění nádorové masy. Je ovšem často provázen problémy s určením ohraničení nádoru. Chirurg má před operací k dispozici pouze informace z předoperačních vyšetření, která naznačují lokalizaci a rozsah nádoru, ale neurčí jasné hranice mezi nádorovou a zdravou tkání. Tuto oblast ve většině případů nelze rozeznat zrakem či hmatem, a pokud není nádor zcela odstraněn, musí pacient podstoupit reoperaci. Cíl: Nové technologie vyvíjené ve výzkumných centrech umožňují operatérovi získat informace o stavu nádorové tkáně v reálném čase přímo na operačním sále v průběhu chirurgického zákroku. Patří mezi ně přístroje MarginProbe, Spectropen a spektroskopický tkáňový skener. Další skupinu tvoří zobrazovací techniky využívající hmotnostní spektrometrii k určování tkáňové specifičnosti. V posledních letech prošla obrovským vývojem technika intraoperativní hmotnostní spektrometrie (REIMS). Využívá elektronický skalpel, kterým chirurg provádí řez tkáně, přičemž vznikající aerosol je odváděn do hmotnostního spektrometru, jenž během několika desetin sekund získá hmotnostní spektra fosfolipidů specifických pro operovanou tkáň (nádorovou či zdravou). V České republice se již tato technologie využívá ve výzkumu k detekci koncentrace léčiva deponovaného v nádorové a zdravé tkáni myší trpících melanomem. Získané výsledky ukazují, že pomocí tohoto přístroje by bylo možné zásadním způsobem ovlivnit léčbu i její účinnost u onkologických onemocnění. O těchto nových technologiích vás v článku budeme podrobněji informovat a seznamovat s jejich principy a využitím.
Background: The treatment of oncological diseases is based on the combination of surgery, representing the key step for the removal of the tumor tissue, radiotherapy, chemotherapy, and hormone therapy. However, the surgery is often accompanied by issue of determining the boundaries of the tumor. Prior the operation, the surgeon has information on preoperative ndings, which indicate the location a
- Klíčová slova
- MarginProbe, SpectroPen, Ramanův skener, REIMS,
- MeSH
- hmotnostní spektrometrie dějiny využití MeSH
- lidé MeSH
- mikroskopie metody využití MeSH
- molekulární patologie metody MeSH
- nádory podle lokalizace MeSH
- nádory * chirurgie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Východiská: Kvantifikácia proteínov v modelových nádorových bunečných líniách a v nádorových tkanivách je často predmetom onkologického výskumu. Metóda SWATH (sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ion spectra), novinka v kvantitatívnej onkoproteomike, získava čoraz väčšiu popularitu, pretože umožňuje kvantifikáciu všetkých proteínov zaznamenaných v spektrálnej knižnici. Spektrálna knižnica obsahuje fragmentačné informácie o každom detekovateľnom proteíne vo vzorke. Dôkladná príprava spektrálnej knižnice výrazne vylepší kvantifikáciu obzvlášť nízkoabundantných proteínov, ktoré často zohrávajú výnamnú úlohu v nádorových ochoreniach. Cieľ: V tomto článku sa venujeme optimalizácii prípravy spektrálnej knižnice s cieľom maximalizovať počet kvantifikovateľných proteínov v modelovej bunečnej línii MCF-7 odvodenej od karcinómu prsníka. Experiment je zameraný na optimalizáciu postupu prípravy vzorky pred vstupom do hmotnostného spektrometru, kde bol skúmaný vplyv zloženia lyzačného pufru, vplyv postupu rozpúšťania peptidov a vplyv materiálu mikroskúmaviek na počet proteínov v spektrálnej knižnici. V neposlednom rade boli optimalizované aj parametre merania na hmotnostnom spektrometri pre získavanie dát do spektrálnej knižnice. Záver: Dôslednou optimalizáciou postupu sa podarilo pripraviť spektrálnu knižnicu obsahujúcu fragmentačné informácie o 1 653 proteínoch (FDR < 1%) z 1 ?g lyzátu MCF-7. Hlavným prínosom optimalizácie postupu prípravy spektrálnej knižnice je rozšírenie pokrytia proteómu vo SWATH digitálnych biobankách umožňujúcich kvantifikáciu ľubovoľného proteínu vo fyzicky už nedostupných vzorkách. Kvalitné spektrálne knižnice by mohli v budúcnosti zohrávať kľúčovú úlohu pri tvorbe digitálnych fingerprintov proteómu pacientov.
Background: Cancer research often focuses on protein quantication in model cancer cell lines and cancer tissues. SWATH (sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ion spectra), the state of the art method, enables the quantication of all proteins included in spectral library. Spectral library contains fragmentation patterns of each detectable protein in a sample. Thorough spectr
- Klíčová slova
- digitální biobanka, SWATH,
- MeSH
- hmotnostní spektrometrie * metody využití MeSH
- lidé MeSH
- nádorové biomarkery * analýza chemie MeSH
- proteiny analýza chemie MeSH
- proteomika metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
A novel method was developed for a parallel, rapid and precise tracking of dopamine and its metabolites (homovanillic acid, 3-methoxytyramine and 3,4-di¬hydroxyphenylacetic acid) in the brain. The method consists of a sample collection using microdialysis from specific brain region, a lyophilization step to concentrate analytes from the microdialysates, and a quantification step exploiting high performance liquid chromatography combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). This was employed in an experimental study investigating the effect of a prenatal exposure to methamphetamine on development of mesolimbic dopaminergic system. It was determined that abusing methamphetamine during pregnancy induces permanent changes in the nucleus accumbens of adult rats. Namely, the basal levels of dopamine and its metabolites are higher and a response to acute dose of methamphetamine is stronger in prenatally exposed rats compared to control rats. Furthermore, the developed methodology can be optimized for use in different brain regions and for analysis of diverse chemical substances. This highly applicable technique could thus be a source of valuable information about brain physiology as well as pathophysiology on the molecular level.
- MeSH
- dopamin * analýza MeSH
- hmotnostní spektrometrie využití MeSH
- lidé MeSH
- methamfetamin analýza MeSH
- mikrodialýza využití MeSH
- modely nemocí na zvířatech MeSH
- poruchy spojené s užíváním amfetaminu * metabolismus patofyziologie MeSH
- poruchy spojené s užíváním opiátů metabolismus patofyziologie MeSH
- potkani Wistar MeSH
- vysokoúčinná kapalinová chromatografie využití MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- zvířata MeSH
Cíl studie: Aplikovat analytické postupy pro stanovení ftalátů, bisfenolu A a jejich metabolitů v různých matricích (moč, krevní sérum, tuková tkáň, infuzní sety) na přístrojové vybavení laboratoře a provést analýzy vzorků poskytnutých klinickými pracovišti. Stanovit expozici ftalátům a bisfenolu A v různých epidemiologických skupinách pacientů a potvrdit či vyvrátit pravděpodobnou expozici těmto látkám při parenterální výživě. Zjistit, zda se ftaláty akumulují v lidské tukové tkáni. Typ studie: průřezová Materiál a metody: V rámci studie byl analyzován biologický materiál (moč, krevní sérum, podkožní tuková tkáň) a infuzní sety pro parenterální léčbu instrumentálními analytickými postupy umožňujícími stanovit obsahy ftalátů, bisfenolu A a jejich metabolitů. Výsledky: U 10 ze 16 analyzovaných metabolitů byla jejich vyloučená množství v moči u více než 50 % vzorků nad mezí stanovitelnosti, např. monoethylftalát – 98,1 % , mono-n-butylftalát – 78,1 % . Nejvyšší koncentrace charakterizované 95. percentilem byly zjištěny u monoethylftalátu – 192,8, mono-n-butylftalátu – 116,7 a mono-(2-ethyl-5-karboxypentyl)ftalátu – 96,9 μg/l. V krevním séru bylo s výjimkou mono-n-butylftalátu zastoupení hodnot menších než mez stanovitelnosti výrazně vyšší. Chromatografické analýzy materiálů vaků a infuzních setů poskytly koncentrace vybraných ftalátů a bisfenolu A pouze v hodnotách pod mezí stanovitelnosti stejně jako v infuzních roztocích. Ve všech vzorcích podkožní tukové tkáně byly stanoveny koncentrace vybraných ftalátů pod mezí stanovitelnosti. Závěr: Koncentrace většiny metabolitů ftalátů v moči jsou měřitelné a umožňují tak analýzy epidemiologických souvislostí s dalšími sledovanými faktory jako je obezita, či diabetes mellitus 2. typu. Zvýšená expozice ftalátům a bisfenolu A u pacientů odkázaných na úplnou parenterální léčbu nebyla prokázána, neboť nebyly tyto látky prokázány v materiálech infuzních setů a ani v infuzních roztocích. Akumulace vybraných ftalátů v podkožní tukové tkáni nebyla zjištěna.
Objective: To apply analytical procedures for the determination of phthalates, bisphenol A and their metabolites in various matrices (urine, blood serum, adipose tissue, infusion sets) to instrumentation available in the lab and perform analysis of samples provided by the clinics. To determine the exposure to phthalates and bisphenol A in different epidemiological groups of patients and to confirm or refute the likely exposure to these substances during parenteral nutrition. To find out whether phthalates accumulate in human adipose tissue. Design: A cross-sectional study Material and Methods: The study analyzed biological material (urine, blood serum, subcutaneous adipose tissue) and infusion sets for parenteral treatment by instrumental analytical techniques, allowing to determine the content of phthalates, bisphenol A and their metabolites. Results: For 10 out of 16 analyzed metabolites, the resulting amounts found in the urine were in the range above the limit of quantitation in more than 50 % of the samples, e.g. monoethyl phthalate – 98.1 % and mono n butyl phthalate 78.1 % of samples. The highest amount characterized by 95 th percentile was recorded for monoethyl phthalate – 192.8, mono-n- butyl phthalate – 116.7, and for mono-(2-ethyl-5-carboxypentyl) phthalate – 96.9 μg/L. In serum, the proportion of values lower than limit of quantitation was high except for mono-n-butyl phthalate. All the concentrations of analyzed phthalates and bisphenol A obtained by chromatographic analysis of materials, bags and infusion sets were below limit of quantitation as well as the concentrations in infusion solutions. In all the samples of subcutaneous adipose fat tissue the determined concentrations of selected phthalates were below limit of quantitation. Conclusion: The concentrations of most metabolites in urine are measurable which makes possible their use in the analyses of epidemiological link to other investigated factors as obesity, or type 2 diabetes mellitus. Increased exposure to phthalates and bisphenol A for patients on total parenteral therapy has not been proven since those substances were detected neither in infusion sets materials nor in infusion solutions. Accumulation of selected phthalates in subcutaneous adipose tissue was not detected
- MeSH
- analýza moči * metody MeSH
- bisfenol A-glycidyl methakrylát analýza MeSH
- estery analýza MeSH
- hematologické testy * metody MeSH
- hmotnostní spektrometrie metody využití MeSH
- klinická studie jako téma MeSH
- kyseliny ftalové * analýza MeSH
- lidé MeSH
- noxy analýza MeSH
- odběr biologického vzorku * metody MeSH
- parenterální výživa přístrojové vybavení MeSH
- tuková tkáň * chemie MeSH
- vysokoúčinná kapalinová chromatografie metody využití MeSH
- vystavení vlivu životního prostředí * analýza MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
For the authentication and adulteration control the lipidomic approach was used. The samples of cow and/or soyabean milk and their mixtures were analyzed by supercritical fluidic chromatography coupled with highresolution mass spectrometry. The obtained data were processed by statistical analysis. The results showed that the above approach and methods can be used for the determination of authenticity and adulteration control of cow and soyabean milk. The amount of foreign milk to the cow or soyabean milk can be also determined from the characteristic triacylglycerol content. This procedure, which is described above, is able to is able to detect 1 % of cow milk in soyabean milk and vice versa.
Meat freshness is an important property and so new methods for freshness evaluation are sought. Unfortunately, the known methods are restricted and so we tried to use quite a new technique – direct analysis in real time (DART) coupled with time-of-flight mass spectroscopy (TOF-MS). This technique using plasma-excited He atoms and atmosphere components can follow up countless changes in meat composition. For extraction of lowmolecular-weight compounds, we used demineralized water, methanol, toluene, chloroform-methanol (2:1) and isopropyl alcohol-hexane (2:1). DART coupled with TOF-MS was used for analysis of extracts. The obtained mass spectra were processed by the principal component analysis (PCA) in order to assess the compositional differences between fresh and spoiled meat. Based on the processed data, it can be concluded that DART coupled with TOF-MS is applicable for evaluation of meat freshness as the values for fresh and stale meat are well separated in scatter plot.
