Biofilm matrix forms a dynamic microenvironment facilitating the resilience of the biofilm. Extracellular DNA (eDNA) is one of the matrix components playing a crucial role in the cell adhesion, aggregation and structure stabilization. Its sticky nature and negative charge reduce the penetration of antimicrobials and further enable the biofilm tolerance or even resistance. The resistance can be encoded in the biofilm matrix genetic information. Moreover, the biofilm matrix with eDNA creates an ideal environment for gene transfer. For all above mentioned reasons, eDNA is a substance with a significant potential for the biofilm disruption in food processing, as well as in medicine. The combination of several different techniques successful in biofilm disruption could facilitate even eradication of the biofilm with various pathogens.

• Klíčová slova
• narušení biofilmu,
• MeSH
• bakteriální léková rezistence MeSH
• biofilmy * účinky léků   MeSH
• DNA bakterií MeSH
• extracelulární matrix MeSH
• rekombinace genetická MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH

• Klíčová slova
• extracelulární DNA,
• MeSH
• akutní poškození ledvin diagnóza   etiologie   MeSH
• biologické markery MeSH
• DNA krev   moč   MeSH
• extracelulární matrix fyziologie   mikrobiologie   MeSH
• lidé MeSH
• nemoci ledvin * MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

Provedli jsme modifikaci a optimalizaci postupů pro izolaci extracelulární DNA z mateřské cirkulace pro neinvazivní určení pohlaví plodu u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění u plodu a pro neinvazivní RHD a RHCE genotypizaci plodu u aloimunizovaných těhotenství s rizikem hemolytického onemocnění plodu. V této studii srovnáváme výsledky amplifikace SRY, RHD a RHCE genu na extracelulární DNA izolované z mateřské periferní krve pomocí QIAamp DSP Virus kitu a QIAamp DNA Blood Mini kitu. Výsledky našich analýz prokázaly, že QIAamp DSP Virus kit zvyšuje výtěžnost extracelulární fetální DNA přítomné v mateřské plazmě, což je klíčové zejména u amplifikace paternálně zděděných alel, které se liší od alel maternálních pouze v jednom nukleotidu. Doporučujeme proto provádět detekci paternální Rhc alely a RhE alely RHCE genu na extracelulární DNA izolované z mateřké plazmy pouze pomocí QIAamp DSP Virus kitu. Pro amplifikaci SRY a RHD genu dostačuje extracelulární DNA extrahovaná z mateřské plazmy prostřednictvím QIAamp DNA Blood Mini kitu. V případě sporných výsledků, tj. při nálezu pozdních amplifikačních cyklů (po 40. cyklu), doporučujeme rovněž provedení PCR analýzy na extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy pomocí QIAamp DSP Virus kitu. Spolehlivá detekce plodů negativních na aglutinogeny, vůči nimž je matka aloimunizována, vylučuje riziko fetální erytroblastózy. Spolehlivá detekce plodů ženského pohlaví u těhotenství s rizikem X-vázaných onemocnění může vyloučit potřebu invazivního prenatálního vyšetření.

We carried out the modification and optimalisation of extracellular fetal DNA isolation from maternal circulation for non-invasive fetal sex determination in pregnancies at risk of X-linked disorders and for non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping in alloimmunized pregnancies at risk of haemolytic disease of newborn. In this study, we compared the results of fetal SRY, RHD and RHCE genotyping by analysis of DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit and QIAamp DNA Blood Mini kit. We showed that QIAamp DSP Virus kit enhanced the recovery of extracellular fetal DNA from maternal plasma that is crucial especially for the detection of those paternally-inherited alleles that differ from maternal alleles only in one nucleotide. Therefore we recommend to perform the detection of fetal Rhc allele and RhE allele of RHCE gene by analysis of extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit only. We showed that the use of extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DNA Blood Mini kit is sufficient for non-invasive fetal SRY and RHD genotyping. In case of controversial results due to the late amplification (Ct ≥ 40) we recommend to perform real-time PCR analysis on extracellular DNA extracted from maternal plasma samples by using QIAamp DSP Virus kit. Reliable non-invasive detection of negative foetuses in alloimmunized pregnancies may exclude the risk of haemolytic disease of newborn. Reliable non-invasive detection of female foetuses in pregnancies at risk of X-linked disorders may exclude the performance of invasive prenatal diagnostic procedures.

• MeSH
• analýza určování pohlaví metody   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• genetické nemoci vázané na chromozom X prevence a kontrola   MeSH
• hemolytická nemoc plodu a novorozence prevence a kontrola   MeSH
• lidé MeSH
• odběr vzorku krve využití   MeSH
• prenatální diagnóza metody   MeSH
• reagenční diagnostické soupravy využití   MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• hodnotící studie MeSH

Nejvýznamnějším zdrojem extracelulárních fetálních nukleových kyselin (DNA a RNA) pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky jsou apoptotická tělíska trofoblastu. V této práci jsme se zaměřili na studium fragmentace extracelulární DNA přítomné v mateřské cirkulaci u 6 těhotných žen v 16. týdnu gravidity. Fragmentovaná extracelulární DNA byla separována podle délky jednotlivých fragmentů metodou gelové elektroforézy a v jednotlivých sekcích o molekulové hmotnosti 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp byla stanovena koncentrace fetální a celkové směsné DNA pomocí PCR v reálném čase s využitím specifických primerů a TaqMan sond pro SRY a GLO geny. Fetální DNA byla detekována pouze ve fragmentech o molekulové hmotnosti 100–300 bp a 300–500 bp. Největší koncentrace fetální DNA se vyskytovala v sekci o molekulové hmotnosti 100–300 bp, kde dosáhla hodnot 14,8 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 1,56–83,2). V sekci o molekulové hmotnosti 300–500 bp bylo detekováno menší množství fetální DNA o koncentracích 1,53 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 0–10,8). V sekcích o molekulové hmotnosti 500–700 bp, 700–900 bp a > 900 bp nebyla fetální DNA detekována. Fetální DNA byla ve frakci o molekulové hmotnosti 100–300 bp 4,8násobně zkoncentrována (rozpětí 0krát–16,6krát) ve srovnání s fetální DNA přítomnou v neseparované extracelulární DNA, která se po izolaci z mateřské plazmy používá pro detekci paternálních alel u plodu. Pokud se zaměříme na izolaci DNA o velikosti fragmentů 100–300 bp, získáme koncentrovanější ale nikoliv purifikovanou fetální DNA. Obsah fetální DNA v této frakci činil 1,15 % (rozpětí 0,16–8,0) ve srovnání s neseparovanou extracelulární DNA, kde podíl fetální DNA tvořil pouze 0,29 % (rozpětí 0,06–1,78). Z naší studie je zřejmé, že metoda koncentrace fetální DNA pomocí separace fragmentované extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy prostřednictvím gelové elektroforézy není vhodná pro rutinní účely.

Apoptotic bodies derived from placental trophoblasts represent the most important source of extracellular fetal nucleic acids (DNA and RNA) for the purpose of non-invasive prenatal diagnosis. In this work we studied the fragmentation of extracellular DNA present in maternal circulation of 6 pregnant women within 16th week of gestation. Extracellular DNA was separated by using agarose gel electrophoresis size-fractionation. Fetal and total circulatory DNA was quantified in individual fractions with an approximate size of 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp by using real-time PCR, specific primers and TaqMan probes for SRY and GLO genes. Fetal circulatory DNA was mainly detected in section with a size 100–300 bp with the concentration of 14.8 GE/ml (range 1.56–83.2). Lower amount of fetal circulatory DNA, 1.53 GE /ml (range 0–10.8), was also found in a fraction with a size 300–500 bp. No fetal DNA was detected in fractions with an approximate size of 500–700 bp, 700–900 bp and more than 900 bp. Circulatory DNA extracted from the gel fragment with a molecular size less than 300 bp contained 4.8 x (range 0x–16.6x) enriched fetal DNA when compared with initial unseparated DNA sample, which has been usually used to detect fetal paternally inherited alleles. If we focused on isolation of DNA with a size of 100–300 bp, we could get more concentrated but not purified fetal DNA. The median percentage of foetal derived DNA in this fraction was 1.15 % (range 0.16–8.0). However median percentage of fetal derived DNA in unseparated extracellular DNA was 0.29 % (range 0.06–1.78). Our experience revealed that the usage of enriched size-fractionated fetal DNA is not suitable for routine clinical applications.

• MeSH
• apoptóza genetika   imunologie   MeSH
• DNA analýza   diagnostické užití   MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• fragmentace DNA genetika   MeSH
• geny pro imunoglobuliny imunologie   MeSH
• geny sry genetika   MeSH
• lidé MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   MeSH
• prenatální diagnóza MeSH
• těhotenství - specifické beta-1-glykoproteiny analýza   diagnostické užití   genetika   MeSH
• těhotenství MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• těhotenství MeSH

Circulating extracellular DNA (ecDNA) is known to worsen the outcome of many diseases. ecDNA released from neutrophils during infection or inflammation is present in the form of neutrophil extracellular traps (NETs). It has been shown that higher ecDNA concentration occurs in a number of inflammatory diseases including inflammatory bowel disease (IBD). Enzymes such as peptidyl arginine deiminases (PADs) are crucial for NET formation. We sought to describe the dynamics of ecDNA concentrations and fragmentation, along with NETosis during a mouse model of chemically induced colitis. Plasma ecDNA concentration was highest on day seven of dextran sulfate sodium (DSS) intake and the increase was time-dependent. This increase correlated with the percentage of cells undergoing NETosis and other markers of disease activity. Relative proportion of nuclear ecDNA increased towards more severe colitis; however, absolute amount decreased. In colon explant medium, the highest concentration of ecDNA was on day three of DSS consumption. Early administration of PAD4 inhibitors did not alleviate disease activity, but lowered the ecDNA concentration. These results uncover the biological characteristics of ecDNA in IBD and support the role of ecDNA in intestinal inflammation. The therapeutic intervention aimed at NETs and/or nuclear ecDNA has yet to be fully investigated.

• MeSH
• biologické markery metabolismus   MeSH
• deoxyribonukleasy metabolismus   MeSH
• DNA krev   metabolismus   MeSH
• endoskopie MeSH
• extracelulární pasti účinky léků   metabolismus   MeSH
• extracelulární prostor metabolismus   MeSH
• kolitida krev   chemicky indukované   patologie   MeSH
• mitochondriální DNA krev   MeSH
• myši inbrední C57BL MeSH
• ornithin analogy a deriváty   farmakologie   MeSH
• peptidylarginindeiminasa typu 4 metabolismus   MeSH
• síran dextranu MeSH
• streptonigrin farmakologie   MeSH
• střeva účinky léků   patologie   MeSH
• střevní sliznice účinky léků   patologie   MeSH
• stupeň závažnosti nemoci MeSH
• zánět krev   patologie   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

This study is focused on the analysis of extracellular DNA (eDNA) from a biofilm matrix formed by Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, and Salmonella enterica. The presence of eDNA in the biofilm of all the studied strains was confirmed by confocal laser scanning microscopy using fluorescent dyes with high affinity to nucleic acid. The protocol for eDNA isolation from the biofilm matrix was established, and subsequent characterization of the eDNA was performed. The purified eDNA obtained from the biofilm matrix of all three microorganisms was compared to the genomic DNA (gDNA) isolated from relevant planktonic grown cells. The process of eDNA isolation consisted of biofilm cultivation, its collection, sonication, membrane filtration, dialysis, lyophilisation, and extraction of DNA separated from the biofilm matrix with cetyltrimethylammonium bromide. An amplified fragment length polymorphism (AFLP) was used for comparing eDNA and gDNA. AFLP profiles showed a significant similarity between eDNA and gDNA at the strain level. The highest similarity, with a profile concordance rate of 94.7% per strain, was observed for S. aureus, L. monocytogenes, and S. enterica exhibited lower profiles similarity (78% and 60%, respectively). The obtained results support the hypothesis that the eDNA of studied bacterial species has its origin in the gDNA.

• MeSH
• DNA bakterií genetika   MeSH
• extracelulární matrix genetika   metabolismus   MeSH
• Listeria monocytogenes genetika   MeSH
• matrix extracelulárních polymerních látek genetika   MeSH
• Salmonella enterica genetika   MeSH
• Staphylococcus aureus genetika   MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

• MeSH
• extracelulární matrix MeSH
• genetická terapie MeSH
• jaterní cirhóza terapie   MeSH
• matrixové metaloproteinasy MeSH
• nemoci jater MeSH

• Konspekt
• Buněčná biologie. Cytologie
• NLK Obory
• cytologie, klinická cytologie
• biologie
• gastroenterologie

• MeSH
• extracelulární vezikuly * MeSH
• volné cirkulující nukleové kyseliny MeSH

• Konspekt
• Lékařské vědy. Lékařství
• NLK Obory
• lékařství

Volná cirkulující DNA (cf‑DNA) je charakterizována jako extracelulární DNA, která může být přítomna v nízkých koncentracích v krvi zdravých jedinců. Cf‑DNA je do krevního řečiště uvolňována apoptózou, ale i nekrózou. Zvýšené hladiny se vyskytují u patologických stavů, jako je zánět, stres či autoimunitní onemocnění. Výrazně zvýšené hodnoty cf‑DNA jsou patrné zejména u pacientů s malignitami, a to především v pokročilých stadiích nemoci. V takovémto případě je nádorově specifická cf‑DNA uvolňována nekrózou z buněk primárního nádoru a metastáz. V poslední době se hodně studií zabývá tzv. liquid biopsy (tekutou biopsií), která umožňuje poměrně snadnou detekci cirkulujících nádorových buněk i cirkulujících molekul nukleových kyselin z periferní krve k diagnostice nádorových onemocnění. Kvantitativní stanovení a detekce genetických a epigenetických změn v cf‑DNA u pacientů s různými malignitami má potenciální využití v molekulární diagnostice, prognóze, monitorování průběhu nemoci a odpovědi na léčbu. Tento článek je zaměřen na potenciální využití cf‑DNA jako krevního biomarkeru u vybraných solidních nádorů a hematologických malignit.

Circulating cell‑free DNA (cf‑DNA) is characterized as extracellular DNA that may be present in the blood of healthy individuals in low concentrations. Cf‑DNA is released by apoptosis or necrosis into the bloodstream. Increased levels are found in pathological conditions, such as inflammation, autoimmune diseases, or stress. Significant increase of cf‑DNA is particularly evident in patients with malignancies, especially in the advanced stages of the disease. In this case, the tumor specific cf‑DNA is released by necrosis from the cells of primary tumor and metastases. Recently, many studies concentrate on the so‑called ‘liquid biopsies’ that allow detection of circulating tumor cells and circulating nucleic acids from peripheral blood for tumor diagnostics. Quantitative methods and detection of genetic and epigenetic alternations of cf‑DNA in patients with different malignancies have potential applications in molecular diagnosis, prognosis, monitoring of disease progression and response to treatment. This review focuses on potential utility of cf‑DNA as a blood biomarker in selected solid tumors and hematologic malignancies. Key words: circulating cell‑free DNA – tumor marker – solid tumors – hematological malignancies This study was supported by grant of Internal Grant Agency of the Czech Ministry of Health NT14575. The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 13. 3. 2015 Accepted: 18. 5. 2015

• MeSH
• biopsie metody   MeSH
• DNA * diagnostické užití   genetika   krev   MeSH
• hematologické nádory genetika   krev   MeSH
• kolorektální nádory krev   MeSH
• lidé MeSH
• metylace DNA MeSH
• mutace MeSH
• nádorové biomarkery MeSH
• nádory plic genetika   krev   MeSH
• nádory prsu genetika   krev   MeSH
• nádory * genetika   krev   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Ulcerative colitis and Crohn's disease constitute the two main forms of inflammatory bowel disease. Prevalence of these diseases increases. In the present day, inadequate and inefficient therapy causes complications and frequent relapse. Extracellular DNA (ecDNA) is the DNA that is outside of cells and may be responsible for activation of the inflammatory response. To determine whether colitis is associated with higher concentration of ecDNA we used male mice of the C57BL/6 strain. Colitis was induced by 2% dextran sulphate sodium (DSS). After 7 days, mice exhibited considerable weight loss compared to the control group. Also, there was a higher stool consistency score and the colon was significantly shorter in comparison to the control group. Higher concentration of ecDNA was found in the DSS group. Interestingly, deoxyribonuclease activity was lower in the colon of the DSS group compared with the negative control. These findings may point to ecDNA as a potential pathogenetic factor and marker of inflammation.

• MeSH
• biologické markery metabolismus   MeSH
• deoxyribonukleasy metabolismus   MeSH
• DNA krev   metabolismus   MeSH
• gastrointestinální trakt enzymologie   MeSH
• kolitida krev   metabolismus   patologie   MeSH
• modely nemocí na zvířatech MeSH
• myši inbrední C57BL MeSH
• síran dextranu MeSH
• tělesná hmotnost MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• mužské pohlaví MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH