Východiska: Karcinom ovaria, závažné nádorové onemocnění s vysokou mortalitou, je v České republice diagnostikováno každým rokem přibližně u 1 000 žen. Riziko vzniku onemocnění je zvýšeno u nosiček mutací v některých nádorových predispozičních genech. S vysokým relativním rizikem (RR > 5) jsou spojeny mutace v genech BRCA1, BRCA2, BRIP1, geny Lynchova syndromu, RAD51C, RAD51D, STK11; s možným zvýšením rizika mutace v genech ATM, CHEK2, NBN, PALB2, BARD1. Cílem práce bylo určit frekvenci mutací v nádorových predispozičních genech v naší populaci. Metody a výsledky: Celkem 1 057 pacientek s karcinomem ovaria a 617 nenádorových kontrol bylo vyšetřeno pomocí panelového sekvenování nové generace na platformě Illumina. Patogenní mutace ve vysoko rizikových genech, vč. velkých genomových přestaveb, byly v našem souboru zachyceny u 30,6 % pacientek; u neselektovaných pacientek byla frekvence mutací téměř 25 %, u pacientek s negativní rodinnou anamnézou 18 %. Nejčastěji mutovanými predispozičními geny byly BRCA1 a BRCA2, součet frekvence mutací v ostatních ovariálních predispozičních genech odpovídal frekvenci mutací v genu BRCA2. Záchyt mutací u pacientek starších 70 let byl více než třikrát vyšší v porovnání s pacientkami ve věku pod 30 let. Závěr: Karcinom ovaria je heterogenní onemocnění s vysokým podílem dědičné formy onemocnění. Vzhledem k nedostatku adekvátních screeningových modalit pro včasnou diagnostiku onemocnění je identifikace nosiček mutací v ovariálních predispozičních genech klíčová, s vysokým potenciálem k celkovému snížení mortality z důvodu karcinomu ovaria.

Background: Ovarian cancer is a disease with high mortality. Approximately 1,000 women are diagnosed with ovarian cancer in the Czech Republic annually. Women harboring a mutation in cancer-predisposing genes face an increased risk of tumor development. Mutations in BRCA1, BRCA2, BRIP1, and Lynch syndrome genes (RAD51C, RAD51D, and STK11) are associated with a high risk of ovarian cancer, and mutations in ATM, CHEK2, NBN, PALB2, and BARD1 appear to increase the risk. Our aim was to examine the frequency of mutations in cancer-predisposing genes in the Czech Republic. Materials and methods: We analyzed 1,057 individuals including ovarian cancer patients and 617 non-cancer controls using CZECANCA panel next-generation sequencing on the Illumina platform. Pathogenic mutations in high-risk genes, including CNVs, were detected in 30.6% of patients. The mutation frequency reached 25.0% and 18.2% in subgroups of unselected ovarian cancer patients and patients with a negative family cancer history, respectively. The most frequently mutated genes were BRCA1 and BRCA2. The overall frequency of mutations in non-BRCA genes was comparable to that in BRCA2. The mutation frequency in ovarian cancer patients aged > 70 years was three times higher than that in patients diagnosed before the age of 30. Conclusion: Ovarian cancer is a heterogeneous disease with a high proportion of hereditary cases. The lack of efficient screening for early diagnosis emphasizes the importance of identifying carriers of mutations in ovarian cancer-predisposing genes; this is because proper follow-up and prevention strategies can reduce overall ovarian cancer-related mortality.

• Klíčová slova
• panel genů,
• MeSH
• geny nádorové MeSH
• klinická studie jako téma MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• nádory vaječníků * genetika   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

Dědičná onemocnění ledvin jsou příčinou renálního selhání u 10–15 % pacientů. K vývojovým anomáliím ledvin přispívají i genetické faktory, které se mohou vyskytovat v rodinách opakovaně. V článku jsou prezentovány dvě kazuistiky molekulárněgenetického vyšetření genů asociovaných s onemocněním ledvin. Na těchto případech je popisován proces klinické a genetické indikace lékařem, následné zpracování vzorku metodou masivního paralelního sekvenování (MPS, NGS – next generation sequencing), Sangerova sekvenování a bioinformatické zpracování hrubých dat. Ta jsou dále hodnocena a interpretována pomocí predikčních programů a odborných databází. V první případové studii byla v rodině nalezena genetická etiologie onemocnění a potvrzena diagnóza. V druhé případové studii nemohla být genetická etiologie onemocnění potvrzena z důvodu nejasné patogenity nalezených variant. Nicméně přesto bude docházet k dispenzarizaci jedinců, u kterých budou tyto varianty nalezeny.

Hereditary kidney diseases are the cause of renal failure in 10-15 % of patients. What also contributes to the development of renal abnormalities are genetic factors that can appear in families repeatedly. The article presents two case studies of molecular genetic testing of genes associated with kidney diseases. The clinical and genetic indication process carried out by the physician is described in these cases, together with the following processing of samples by massive parallel sequencing (MPS, NGS – next-generation sequencing), Sanger sequencing, and bioinformatic processing of raw data. These are further evaluated and interpreted using prediction programs and professional databases. In the first case study, a genetic etiology for the disease was discovered in the family and a diagnosis was confirmed. In the second case study, the genetic etiology of the disease could not have been confirmed due to the unclear pathogenicity of the variants found. Nevertheless, there will be dispensarization of individuals in whom these variants will be found.

• MeSH
• diagnostické techniky molekulární MeSH
• dítě MeSH
• genetické nemoci vrozené * MeSH
• indukovaný porod MeSH
• lidé MeSH
• nemoci ledvin * vrozené   MeSH
• plod abnormality   MeSH
• polycystická choroba ledvin diagnóza   genetika   MeSH
• polycystické ledviny autozomálně recesivní diagnóza   genetika   MeSH
• sekvenční analýza DNA MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• kazuistiky MeSH

OBJECTIVES: Direct genotyping of adenovirus or enterovirus from clinical material using polymerase chain reaction (PCR) followed by Sanger sequencing is often difficult due to the presence of multiple virus types in a sample, or due to varying efficacy of PCR amplifying the capsid gene on the background of foreign nucleic acids. Here we present a simple protocol for virus genotyping using massive parallel amplicon sequencing. METHODS: The protocol utilized a set of 16 tailed degenerate primers flanking the seventh hypervariable region of the adenovirus hexon gene and 9 tailed degenerate primers targeted to the proximal portion of the enterovirus VP1 gene. Subsequent addition of dual indices enabled simultaneous sequencing of 384 different samples on an Illumina MiSeq instrument. Downstream bioinformatic analysis was based on remapping to a set of references representative of the presently known repertoire of virus types. RESULTS: After validation with known virus types, the sequencing method was applied on 301 adenovirus-positive samples and 350 enterovirus-positive samples from a longitudinally collected series of stools from 83 children aged 3 to 36 months. We detected 7 different adenovirus types and 27 different enterovirus types. There were 37 (6.2%) samples containing more than one genotype of the same viral genus. At least one dual infection was experienced by 23 of 83 (28%) of the children observed over the 3 years' observation period. CONCLUSIONS: Amplicon sequencing with a multiplex set of degenerate primers seems to be a rapid and reliable technical solution for genotyping of large collections of samples where simultaneous infections with multiple strains can be expected.

• MeSH
• Adenoviridae klasifikace   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• adenovirové infekce virologie   MeSH
• DNA primery genetika   MeSH
• enterovirové infekce virologie   MeSH
• Enterovirus klasifikace   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• genotyp * MeSH
• genotypizační techniky metody   MeSH
• kojenec MeSH
• lidé MeSH
• longitudinální studie MeSH
• předškolní dítě MeSH
• sekvenční analýza DNA metody   MeSH
• výpočetní biologie MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• kojenec MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• předškolní dítě MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• hodnotící studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Geografické názvy
• Norsko MeSH

AIMS: Amyloidosis is caused by deposition of abnormal protein fibrils, leading to damage of organ function. Hereditary amyloidosis represents a monogenic disease caused by germline mutations in 11 amyloidogenic precursor protein genes. One of the important but non-specific symptoms of amyloidosis is hypertrophic cardiomyopathy. Diagnostics of hereditary amyloidosis is complicated and the real cause can remain overlooked. We aimed to design hereditary amyloidosis gene panel and to introduce new next-generation sequencing (NGS) approach to investigate hereditary amyloidosis in a cohort of patients with hypertrophic cardiomyopathy of unknown significance. METHODS: Design of target enrichment DNA library preparation using Haloplex Custom Kit containing 11 amyloidogenic genes was followed by MiSeq Illumina sequencing and bioinformatics identification of germline variants using tool VarScan in a cohort of 40 patients. RESULTS: We present design of NGS panel for 11 genes (TTR, FGA, APOA1, APOA2, LYZ, GSN, CST3, PRNP, APP, B2M, ITM2B) connected to various forms of amyloidosis. We detected one mutation, which is responsible for hereditary amyloidosis. Some other single nucleotide variants are so far undescribed or rare variants or represent common polymorphisms in European population. CONCLUSIONS: We report one positive case of hereditary amyloidosis in a cohort of patients with hypertrophic cardiomyopathy of unknown significance and set up first panel for NGS in hereditary amyloidosis. This work may facilitate successful implementation of the NGS method by other researchers or clinicians and may improve the diagnostic process after validation.

• MeSH
• dospělí MeSH
• familiární amyloidóza diagnóza   genetika   MeSH
• fenotyp MeSH
• frekvence genu MeSH
• genetická predispozice k nemoci MeSH
• genetické markery MeSH
• hypertrofická kardiomyopatie diagnóza   genetika   MeSH
• jednonukleotidový polymorfismus * MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mutace * MeSH
• mutační analýza DNA metody   MeSH
• pilotní projekty MeSH
• prediktivní hodnota testů MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• rizikové faktory MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• stanovení celkové genové exprese metody   MeSH
• transkriptom * MeSH
• výpočetní biologie MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• Geografické názvy
• Česká republika MeSH

The aim of this study was to identify the molecular genetic cause of disease in posterior polymorphous corneal dystrophy (PPCD) probands of diverse origin and to assess the utility of massively parallel sequencing in the detection of ZEB1 mutations. We investigated a total of 12 families (five British, four Czech, one Slovak and two Swiss). Ten novel and two recurrent disease-causing mutations in ZEB1, were identified in probands by Sanger (n = 5), exome (n = 4) and genome (n = 3) sequencing. Sanger sequencing was used to confirm the mutations detected by massively parallel sequencing, and to perform segregation analysis. Genome sequencing revealed that one proband harboured a novel ∼0.34 Mb heterozygous de novo deletion spanning exons 1-7 and part of exon 8. Transcript analysis confirmed that the ZEB1 transcript is detectable in blood-derived RNA samples and that the disease-associated variant c.482-2A>G leads to aberrant pre-mRNA splicing. De novo mutations, which are a feature of PPCD3, were found in the current study with an incidence rate of at least 16.6%. In general, massively parallel sequencing is a time-efficient way to detect PPCD3-associated mutations and, importantly, genome sequencing enables the identification of full or partial heterozygous ZEB1 deletions that can evade detection by both Sanger and exome sequencing. These findings contribute to our understanding of PPCD3, for which currently, 49 pathogenic variants have been identified, all of which are predicted to be null alleles.

• MeSH
• dědičné dystrofie rohovky diagnóza   genetika   metabolismus   MeSH
• dítě MeSH
• DNA genetika   MeSH
• dospělí MeSH
• exony MeSH
• heterozygot MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mladiství MeSH
• mladý dospělý MeSH
• mutace * MeSH
• mutační analýza DNA MeSH
• předškolní dítě MeSH
• rodokmen MeSH
• sekvence nukleotidů MeSH
• sekvenční delece MeSH
• senioři MeSH
• transkripční faktor Zeb1 genetika   metabolismus   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• zinkové prsty MeSH
• Check Tag
• dítě MeSH
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mladiství MeSH
• mladý dospělý MeSH
• předškolní dítě MeSH
• senioři MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• Publikační typ
• abstrakt z konference MeSH

Sekvenování nové generace, nazývané také masivně paralelní sekvenování (MPS), je v současnosti nejrychleji se rozvíjející metodou molekulární genetiky, která přinese zlom v oblasti personalizované medicíny. V tomto přehledu stručně popisujeme hlavní typy MPS, kterými jsou celogenomová a exomová sekvenace, sekvenace transkriptomu a amplikonové sekvenování. Dále je uveden souhrn výhod, nevýhod a možných aplikací technologií nabízených v současnosti v České republice.

Next generation or massive parallel sequencing (MPS) is a rapidly advancing method in molecular genetics that will bring significant changes in the personalized medicine field. In this review we briefly describe major types of MPS, including whole-genome, -exome, -transcriptome and amplicon sequencing. We also present an overview of the advantages, drawbacks and possible applications of sequencing technologies available in the Czech Republic.

• Klíčová slova
• masivně paralelní sekvenování, amplikonové sekvenování, sekvenování nové generace,
• MeSH
• exom MeSH
• lidé MeSH
• sekvenční analýza DNA * ekonomika   přístrojové vybavení   trendy   MeSH
• sekvenční analýza RNA metody   MeSH
• transkriptom MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * ekonomika   metody   přístrojové vybavení   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Although genetic lesions responsible for some mendelian disorders can be rapidly discovered through massively parallel sequencing of whole genomes or exomes, not all diseases readily yield to such efforts. We describe the illustrative case of the simple mendelian disorder medullary cystic kidney disease type 1 (MCKD1), mapped more than a decade ago to a 2-Mb region on chromosome 1. Ultimately, only by cloning, capillary sequencing and de novo assembly did we find that each of six families with MCKD1 harbors an equivalent but apparently independently arising mutation in sequence markedly under-represented in massively parallel sequencing data: the insertion of a single cytosine in one copy (but a different copy in each family) of the repeat unit comprising the extremely long (~1.5-5 kb), GC-rich (>80%) coding variable-number tandem repeat (VNTR) sequence in the MUC1 gene encoding mucin 1. These results provide a cautionary tale about the challenges in identifying the genes responsible for mendelian, let alone more complex, disorders through massively parallel sequencing.

• MeSH
• cytosin metabolismus   MeSH
• genetická vazba MeSH
• haplotypy MeSH
• lidé MeSH
• minisatelitní repetice * genetika   MeSH
• mucin 1 * genetika   metabolismus   MeSH
• mutace * MeSH
• polycystické ledviny autozomálně dominantní * MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• ženské pohlaví MeSH

The information on candidate cancer driver alterations available from public databases is often descriptive and of limited mechanistic insight, which poses difficulties for reliable distinction between true driver and passenger events. To address this challenge, we performed in-depth analysis of whole-exome sequencing data from cell lines generated by a barrier bypass-clonal expansion (BBCE) protocol. The employed strategy is based on carcinogen-driven immortalization of primary mouse embryonic fibroblasts and recapitulates early steps of cell transformation. Among the mutated genes were almost 200 COSMIC Cancer Gene Census genes, many of which were recurrently affected in the set of 25 immortalized cell lines. The alterations affected pathways regulating DNA damage response and repair, transcription and chromatin structure, cell cycle and cell death, as well as developmental pathways. The functional impact of the mutations was strongly supported by the manifestation of several known cancer hotspot mutations among the identified alterations. We identified a new set of genes encoding subunits of the BAF chromatin remodeling complex that exhibited Ras-mediated dependence on PRC2 histone methyltransferase activity, a finding that is similar to what has been observed for other BAF subunits in cancer cells. Among the affected BAF complex subunits, we determined Smarcd2 and Smarcc1 as putative driver candidates not yet fully identified by large-scale cancer genome sequencing projects. In addition, Ep400 displayed characteristics of a driver gene in that it showed a mutually exclusive mutation pattern when compared with mutations in the Trrap subunit of the TIP60 complex, both in the cell line panel and in a human tumor data set. We propose that the information generated by deep sequencing of the BBCE cell lines coupled with phenotypic analysis of the mutant cells can yield mechanistic insights into driver events relevant to human cancer development.

• MeSH
• exom genetika   MeSH
• fibroblasty MeSH
• lidé MeSH
• mutace MeSH
• myši MeSH
• nádorová transformace buněk genetika   MeSH
• nádorové proteiny genetika   MeSH
• nádory genetika   MeSH
• primární buněčná kultura MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování * MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• myši MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• Research Support, N.I.H., Extramural MeSH

Metagenomic high-throughput sequencing (mHTS) is a hypothesis-free, universal pathogen detection technique for determination of the DNA/RNA sequences in a variety of sample types and infectious syndromes. mHTS is still in its early stages of translating into clinical application. To support the development, implementation and standardization of mHTS procedures for virus diagnostics, the European Society for Clinical Virology (ESCV) Network on Next-Generation Sequencing (ENNGS) has been established. The aim of ENNGS is to bring together professionals involved in mHTS for viral diagnostics to share methodologies and experiences, and to develop application recommendations. This manuscript aims to provide practical recommendations for the wet lab procedures necessary for implementation of mHTS for virus diagnostics and to give recommendations for development and validation of laboratory methods, including mHTS quality assurance, control and quality assessment protocols.

• MeSH
• metagenomika * MeSH
• viry * genetika   MeSH
• vysoce účinné nukleotidové sekvenování MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH