K detekci apoptózy (AP) na tkáňových řezech lze využít morfologické hodnocení AP figur světelnou či elektronovou mikroskopií a imunohistochemícky průkaz antigénu asociovaných s AP. Bcl2 u řady nádorů inverzně koreluje s AP a je nepřímým markerem počtu AP figur. Imunohistochemícky průkaz je bezproblémový. Tkáňovou transglutaminázu, která je výrazně exprimována i v neapoptotických buňkách, nelze považovat za specifický marker AP. Podobně FAS, jehož exprese nemusí být bezpodmínečně spojena se vstupem buňky do AP. Kaspázy: v současnosti používaná imunohistochemická detekce nerozlišuje aktivní a neaktivní formy těchto enzymů. Anexin V: technika, detekující fosfatidylserin, normálně lokalizovaný na vnitřní straně buněčné membrány, jenž je při apoptotickém procesu detekovatelný i extracelulámě. Průkaz Anexinu V značeného koloidním zlatem lze využít k detekci AP imunoelektronovou mikroskopií, nicméně jde o velmi náročnou metodiku. TUNEL, ISEL, ISNTA jsou metody, které označují zlomy DNA vznikající při apoptóze. TUNEL ve srovnání s morfologickým hodnocením AP figur detekuje o cca 20 % apoptotických buněk více. Označeny mohou být i fragmenty DNA vznikající v jádrech během reparace, po elektrokoagulaci, při autolýze, následkem fixace a řezání tkání. Apostain je metoda založená na průkazu jednovláknových zlomů DNA pomocí monoklonální protilátky, která využívá sníženou stabilitu apoptotické DNA vůči termální denaturaci způsobující její zlomy. Protilátka M30 CytoDeath detekuje neoepitopy vzniklé při štěpení cytokeratinů 18 kaspázami. Ve srovnání s TUNELem chybí exprese v nekrotických buňkách, neoznačuje však buňky v pokročilých stadiích AP (tělíska). Na rozdíl od některých pilotních studií se nám u M30 (Roche) nepodařilo docílit dostatečnou senzitivitu ani specificitu při detekci AP na mamámích karcinomech. Rutinní, resp. automatizované hodnocení AP vyžaduje ověření a standardizaci dalších metodik.

Signs Methods for identification of apoptotic (AP) cells in tissue sections include light and electron microscopy and immunohistochemical (IHC) detection of apoptotic antigens. BcI-2 at many tumors inversely correlates with AP and is an indirect marker of AP index. Transglutaminase is often expressed in nonapoptotic cells, and thus represents a non specific marker of AP. Likewise, expression of FAS does not necessarily represent a transformation into AP. IHC detection of caspases does not distinguish between active and nonactive forms of the proteases. Immunolabeling of biotin-conjugated Annexin V is used for the identification of phosphatidylserine residues exposed on the surface of AP cells. Annexin V immuno-gold labeling by means of electron microscopy will allow a more refined description of the morphological events occurring during apoptosis. TUNEL, ISEL and ISNTA methods detect DNA breaks. The rate of AP detected by TUNEL is about 20 % higher then by apoptotic figure counting. DNA strand breaks can also occur during DNA repair, electrocoagulation, autolysis, fixation and paraffin embedding. With Apostain, DNA is selectively denaturated bv heatinef with formamide and stained by monoclonal antibody specific to single-strand DNA. It specifically stains condensed chromatin of apoptotic cells. M30 IHC uses a monoclonal antibody binding to the product resulting from cleavage of cytokeratin 18 by activated caspases. M30 is negative in necrotic cells and in progressively degraded cells (AP bodies). In contrast to some pilot studies, we have not reached sufficient sensitivity and specificity of IHC detection with M30 (Roche) in breast carcinomas.

Oddělení patologie Masarykův onkologický ústav Brno

Apoptosis - selected detection methods of apoptosis and associated regulatory factors in histologic slides of tumors

Apoptóza - vybrané metody detekce apoptózy a asociovaných regulačních faktorů na tkáňových řezech z nádorového materiálu = Apoptosis - selected detection methods of apoptosis and associated regulatory factors in histologic slides of tumors /

Apoptosis - selected detection methods of apoptosis and associated regulatory factors in histologic slides of tumors /

Lit: 21

Souhrn: eng