Cíl práce: Navržení a validace real-time PCR, vhodné pro kvantitativní průkaz C. pneumoniae a C. trachomatis v klinických vzorcích. Materiál a metody: Jako cílový úsek pro amplifikaci byla zvolena část genu pro 16S RNA. Pomocí klonování produktu reakce v bakteriálním plazmidu byl připraven rekombinantní kalibrátor a kombinovaný interní standard, který lze použít ve třech různých PCR. Pro validaci byly použity archivované izoláty DNA z různých klinických vzorků, izoláty DNA z dalších infekčních agens a kontrolní vzorky pro detekci DNA CT (QCMD) a CPN (Instand). Výsledky: Byla ověřena specificita a reprodukovatelnost reakce. Analytická citlivost byla stanovena na 5–10 kopií bakteriálního genomu/reakci. 105 izolátů DNA z různých typů klinických vzorků (výtěry, moče, periferní krev, BAL) bylo vyšetřeno pomocí real-time PCR a konvenční PCR. Vzorky, které poskytly nesouhlasný výsledek, byly charakterizovány pomocí třetího nezávislého amplifikačního testu. Citlivost a specificita real-time PCR byla 89 % a 100 %. Metoda je vhodná pro screening i diagnostiku chlamydií.

Study objective: Design and validation of a real-time PCR assay for quantitative detection of C. pneumoniae and C. trachomatis in clinical specimens. Material and Methods: A part of the 16S RNA gene was selected as the target sequence for amplification. The reaction product was cloned in the bacterial plasmid and a recombinant calibrator and a combined internal standard were prepared, usable in three different PCR assays. Archived DNA isolates from various clinical specimens, DNA isolates from other infectious agents and control samples for DNA detection, CT (QCMD) and CPN (Instand), were used for validation. Results: Reaction specificity and reproducibility were tested. The analytical sensitivity was set to 5–10 copies of the bacterial genome/reaction. As many as 105 DNA isolates from various types of clinical specimens (swabs, urine, peripheral blood and BAL fluid) were tested by real-time PCR and conventional PCR assays. The specimens that had not yielded concordant results were characterized by a third independent amplification test. The sensitivity and specificity of real-time PCR were 89 % and 100 %, respectively. The assay is suitable for both screening and diagnosis of Chlamydia.

NRL pro chlamydie Centrum epidemiologie a mikrobiologie Státní zdravotní ústav Praha

Simultaneous detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia trachomatis DNA by real-time PCR

Lit.: 31