Východiska: Cílem této práce je představit algoritmus separace plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně pacientů s mnohočetným myelomem. Zisk vysoce čistých buněčných populací je základní podmínkou aplikace moderních výzkumných postupů u tohoto onemocnění. Materiál a metody: Vzorky kostní dřeně byly získány od pacientů z Interní hematoonkologické kliniky FN Brno. Kostní dřeň byla nejprve zbavena červené složky (metodou hustotní gradientové centrifugace nebo lyzace), plazmatické buňky byly označeny monoklonální protilátkou proti syndecanu-1 (CD138) a separovány magneticky nebo na buněčném sorteru. Čistota separované populace byla vyhodnocena na průtokovém cytometru, případně morfologicky. Výsledky: Paralelně, magnetickou a fluorescenční separací, bylo zpracováno 28 vzorků kostní dřeně a byla vyhodnocena čistota separovaných frakcí. Na základě statistického hodnocení výsledných čistot jak v celém souboru vzorků, tak ve skupinách podle vstupního zastoupení plazmatických buněk byl navržen algoritmus separace s cut-off hodnotou 5 % plazmatických buněk v mononukleární frakci KD: vzorky s < 5 % plazmatických buněk jsou nadále tříděny na buněčném sorteru, vzorky s ? 5 % plazmatických buněk jsou separovány na magnetickém separátoru. Po ročním vyhodnocení uplatnění tohoto algoritmu na souboru 210 vzorků kostní dřeně se medián čistoty separovaných plazmatických buněk zvedl z 62,4 % (0,4–99,6 %) na 94,0 % (23,9–100 %). Závěr: Zavedení metodiky fluorescenčního třídění výrazně přispělo k celkovému zvýšení úspěšnosti separace plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně, a to především u vzorků s jejich nízkým vstupním zastoupením, kde dosud využívaná metodika magnetické separace není dostatečně účinná. Otevřela se tím také cesta k separaci plazmatických buněk ze vzorků kostní dřeně od jedinců s monoklonální gamapatií nejasného významu, kde je zastoupení plazmatických buněk typicky velmi nízké (desetiny, max. jednotky procent).

Backgrounds: The aim of this paper is to present an algorithm for plasma cell separation from bone marrow samples of multiple myeloma patients. The main prerequisite for applying modern research methods in this disease is gaining pure cell populations. Material and Methods: Bone marrow samples were collected from outpatients or inpatients of the Internal Haematology and Oncology Clinic of the Faculty Hospital Brno, after they had signed an Informed Consent Form. The bone marrow was first depleted of red cells (by density gradient centrifugation or erythrolysis), plasma cells were labelled by monoclonal antibody against syndecan-1 (CD138) and separated either magnetically or by cell sorter. The purity of separated population was evaluated by flow cytometry or, alternatively, morfologically. Results: We processed 28 bone marrow samples, in parallel, by magnetic or fluorescence-based separation, and we evaluated the purity of the separated fractions. Based on a statistical evaluation of resulting purities in the entire sample set as well as the individual groups divided according to the initial plasma cell content, a separation algorithm was proposed with a cut-off value of 5% of plasma cells in mononuclear fraction of bone marrow: samples with less than 5% of plasma cells are henceforth separated on cell sorter, samples with more than 5% are separated magnetically. The effectiveness of this algorithm was evaluated after the first year of its application on a dataset of 210 bone marrow samples: median purity of the separated plasma cells increased from 62.4% (0.4–99.6%) to 94.0% (23.9–100%). Conclusion: The introduction of a fluorescence-based separation markedly increased the effectiveness of plasma cell separation from bone marrow samples, mainly in samples with low plasma cell content where magnetic separation used thus far is not sufficient. This finding also opened a door for plasma cell separation of bone marrow samples from patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance, where plasma cell count is typically below or just over one percent.

Babákův výzkumný institut LF MU Brno

Plasma cell separation algorithm from bone marrow samples

Lit.: 20