Cíle studie: Cílem studie bylo vytvořit protokol pro zpracování vzorků moči pro získání aminokyselinových profilů pomocí iontově výměnné chromotografie s detekcí ve viditelném spektru (IEC/Vis) na základě tvorby komplexů aminokyselin s ninhydrinem a následné zkrácení času analýzy pro klinicky zajímavé molekuly (sarkosin či taurin), které mohou byt využity jako potenciální nádorové biomarkery. Typ studie: Metodická Materiál a metody: Vzorky moči, odebrané pacientům s diagnostikovaným karcinomem prostaty (n = 500) byly shromažďovány po dobu 1 roku a uskladňovány při teplotě -80°C. Pro vlastní analýzu aminokyselinových profilů byly vzorky připraveny kyselou hydrolýzou v mikrovlnném reaktoru. Za optimalizovaných podmínek (80 W, 120°C, 25 bar, 105 min) bylo 500 μl vzorku, smíchaného s 500 μl 35% kyseliny chlorovodíkové zhydrolyzováno na výsledný produkt, který byl následně ředěn pufrem sodíkového cyklu (0,2 mol/l NaCl, 60 mmol/l C6H807, 1,5 mmol/l N3Na a 0,4 % S(CH2CH2OH)2). Po centrifugaci (25 000 g při 4°C, 20 min) byly vzorky neutralizovány (0,6 mol/l NaOH) a analyzovány iontově-výměnnou kapalinovou chromatografií s postkolonovou derivatizací ninhydrinem využívající optickou detekci při vlnových délkách λ = 440 a 570 nm. Pro detekci sarkosinu a taurinu byly vzorky připraveny odpařením 250 μl vzorku na dusíkové odparce (40 min, teplota dusíku 60°C, tlak 1 bar) a následně resuspendovány pufrem sodíkového cyklu (250 μl). Výsledky a závěr: Analýzou aminokyselinových profilů (n = 500) bylo zjištěno, že lze docílit získání důležitých informací z neinvazivně odebraných vzorků moči. Použití dusíkové odparky redukuje manipulaci se vzorkem a zlepšuje opakovatelnost analýzy. Zkrácená analýza sarkosinu a taurinu ze vzorků odpařených na dusíkové odparce může sloužit jako metoda pro citlivou a nízkonákladovou analýzu klinických vzorků.

Objective: The aim of our study was to prepare a protocol for pre-treatment of clinical urinary samples, subsequently employed for acquirement of amino acid profiles via ion exchange chromatography with detection in visible spectrum (IEC/ Vis). Further for clinically interesting biomolecules as sarcosine and taurine the optimization was carried out to shorten the analysis time. Design: Methodological Material and methods: Urine specimens from patients diagnosed with prostate cancer (n = 500) were collected within 1 year and stored in -80°C. Samples were processed for analysis of amino acid profiles through acidic hydrolysis in a microwave reactor. Using optimized conditions (80 W, 120°C, 25 bar, 105 min), 500 μL sample, mixed with 500 μL of 35% hydrochloric acid hydrolyzed. That resulted in product, which was subsequently diluted in buffer of sodium cycle (0.2 mol/L NaCl, 60 C6H807 mmol/L, 1.5 mmol/L and 0.4% N3Na S(CH2CH2OH)2). After centrifugation (25000 g at 4°C, 20 min), the samples were neutralized (0.6 mol/l NaOH) and analyzed using ion-exchange liquid chromatography with post-column derivatization with ninhydrin, using the detection wavelength λ = 440 and 570 nm (IEC/Vis). For analysis of sarcosine and taurine, the samples were prepared by evaporation of 250 μL of sample employing a nitrogen evaporator (40 min, temperature 60°C. Nitrogen pressure of 1 bar) and resuspended with buffer of sodium cycle (250 μL). Results and conclusion: The analyses of amino acid profiles offer interesting clinical information not only in non-invasively collected urinary samples, but also in other organic matrices. Employment of nitrogen evaporator for sample pre-treatment leads to reduction of manipulation with sample and its combination with shortened analyses times of sarcosine and taurine may serve as a sensitive and low-cost method for analysis of clinical specimens.

Středoevropský technologický institut VUT v Brně Technická 3058 10 CZ 616 00 Brno Česká republika

Urologická klinika 2 Lékařská fakulta Univerzity Karlovy a FN 5 Motole 5 Úvalu 84 CZ 150 06 Praha 5 Česká republika

Ústav chemie a biochemie Mendelova univerzita v Brně Zemědělská 1 CZ 613 00 Brno Česká republika

Chromatographic characterization of amino acid profiles in urinary samples of patients suffering from prostate carcinoma

Literatura