Cíl: Cílem této práce bylo vyvinout nanoléčivo založené na specifickém transportu pomocí oligonukleotidové próby (komplementární k BRCA1 genové mutaci) s předpokládaným účinkem cytostatika bez výrazných toxických efektů k nenádorovým buňkám. Použitým cytostatikem bylo antracyklinové antibiotikum doxorubicin. Přes svou terapeutickou účinnost však vykazuje vysokou kardiotoxicitu. Možnost, jak zvýšit terapeutické okno, představují nanotransportéry. Metodika: Doxorubicin a oligonukleotidová próba byly navázány k fullerenům. Doba modifikace nanotransportérů byla 24 h. Nanotransportér byl následně charakterizován pomocí biofyzikálních technik (SEM, dynamického rozptylu světla, spektrální a elektrochemické metody). Pomocí elektrochemické a fluorescenční analýzy byl vzniklý komplex nanotransportéru potvrzen. Výsledky: Doxorubicin se záporně nabitým povrchem interaguje s kladně nabitými fullereny elektrostatickou interakcí a tato interakce byla potvrzena na základě elektronové mikroskopie (SEM), elektrochemicky (změna potenciálu byla 35 mV) a měřením dynamického rozptylu světla (změna ζ-potenciálu byla 22 mV). Ke komplexu byla amidovou vazbou připojena oligonukleotidová proba, která je komplementární k mutované sekvenci BRCA genu. Pokles fluorescenčního signálu nanokonstruktu o 80 % indikoval navázání oligonukleotidu. Pro prokázání funkčnosti byla navržena magnetická zlatá nanočástice modifikovaná komplementární sekvencí k testovanému nanotransportéru. Závěr: Předpokládáme, že navržený nanokonstrukt bude možné využít pro DNA cílené směřování protinádorového léčiva k buňkám s mutací v genu BRCA. Nanotransportér má tyto základní vlastnosti: a) fulleren vykazuje vysokou afinitu k buňce a proniká cytoplazmatickou membránou; b) doxorubicin se uvolní do cytoplazmy v nádorových buňkách díky nízkému pH; c) celý konstrukt je směřován cíleně na mutovanou sekvenci genu BRCA; d) zlatá nanočástice zesiluje cytotoxický efekt

Objective: Main goal of this project was to develop a nanotransporter based on a targeted delivery using oligonucleotide probe, which is complementary to a mutated BRCA1 gene sequence with the expected effect of a cytostatic without significant toxic effects. The mentioned cytostatic is often used doxorubicin. Despite its therapeutic efficacy, however, it exhibits high cardiotoxicity. Nanotransporters represent the possibility of increasing the therapeutic window. Methods: Doxorubicin and oligonucleotide probe were bound to fullerenes. The modification time was 24 hours. The nanotransporter was subsequently characterized by biophysical techniques (SEM, dynamic light scattering, spectral and electrochemical methods.) Using the electrochemical and fluorescence analysis the formation of nanotransporter was confirmed. Results: Doxorubicin with a negatively charged surface interacts with positively charged fullerenes by electrostatic interaction and this interaction was confirmed by on the basis of electron microscopy (SEM), electrochemically (change of potential was 35 mV) and by measurement of dynamic light scattering (change of ζ-potential was 22 mV). Oligonucleotide probe, which is complementary to the BRCA mutated gene sequence, was bound to the complex by an amide bond. The drop of the fluorescence signal by 80% indicated binding of the oligonucleotide. To demonstrate the functionality, a magnetic gold nanoparticle, modified by the complementary sequence to the tested nanotransporter, was developed. Conclusion: We assume, that the proposed nanotransporter will be used for DNA targeted delivery of the antitumor drug to the cells with BRCA mutated genes. The nanotransporter has these basic characteristics: a) fullerene has a high affinity to the cell and penetrates the cell membrane; b) doxorubicin is released into cytoplasm in tumour cells due to low pH; c) the entire construct is targeted to the BRCA mutated gene sequence; d) the gold nanoparticle enhances the cytotoxic effect.

Ústav biomedicínských a environmentálních analýz Wroclaw Medical University Wroclaw Polsko

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Farmaceutická fakulta Centrální laboratoře

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno Farmaceutická fakulta Ústav humánní farmakologie a toxikologie

Nanomedical approach in targeted therapy of breast cancer: use of carbon nanostructures