Úvod a cíl: Apikální periodontitida (AP) je zánětlivé onemocnění zubních periradikulárních tkání vyvolané bakteriální infekcí. Ke stanovení bakterií osídlujících kořenové kanálky jsou využívány různé metodické přístupy, analýza bakteriomu celého kořenového systému zubu postiženého AP je však zatím stále výzvou. Cílem naší přehledové práce bylo vytvořit literární rešerši zaměřenou na postupy pro odběr vzorku a metodiku pro analýzu bakteriomu a poté navrhnout vhodný metodický přístup k účelu studia etiopatogeneze tohoto onemocnění. Metodika: Po vyhledávání v databázi PubMed jsme do rešerše vybrali pouze publikační výstupy typu původní práce, ve kterých byla analyzována bakteriální DNA lidských zubů. Výsledky: Metodicky se studie mezi sebou velmi liší, a to jak způsobem odběru vzorku, izolací DNA, tak i samotnou analýzou bakteriální DNA. Častým způsobem odběru vzorku je využití sterilních endodontických papírových čepů. Tento způsob odběru vzorku je sice vhodný v rámci klinické praxe, avšak pro komplexní analýzu prostředí kořenového systému je považován za nedostatečný, a to kvůli samotné morfologii zubu a přítomnosti ramifikací. Jiným způsobem odběru vzorku je resekce kořenového hrotu pomocí sterilních fréz a následné rozemletí apexu nebo provedení stěru sterilními endodontickými papírovými čepy. Ke stanovení bakteriomu je tak využívána pouze apikální část zubu, tudíž bakterie, které kolonizují koronární část zubu a podílejí se na etiopatogenezi onemocnění, nemohou být analyzovány. V recentních studiích je využívána metoda, při které je celý extrahovaný zub postižený AP nadrcen na jemný homogenní prach pomocí kryogenního mletí. Z prachu nadrceného zubu je možné stanovit komplexní bakteriom kořenového systému i dřeňové dutiny, a proto se tento způsob z pohledu přípravy vzorku pro experimentální studii jeví jako optimální. Nejčastěji je při izolaci DNA využívána efektivní kolonková metoda různými purifikačními soupravami a k následné analýze DNA slouží většinou metodiky založené na principu polymerázové řetězové reakce. Sekvenování variabilních oblastí genu pro 16S rRNA je v dnešní době již zlatým standardem pro kategorizaci bakterií a charakterizaci bakteriálních komunit. Závěr: Ke studiu bakteriomu AP se jeví jako nejvhodnější použít vzorky extrahovaných zubů a bezprostředně je zamrazit bez dalších preanalytických kroků. Nadrcený zub je při dodržení sterilních podmínek při kryogenním mletí vhodnou matricí pro izolaci mikrobiální DNA komerčně dostupnými kity. V současné době je pro stanovení bakteriomu a získání informace o relativní abundanci bakteriálních rodů, a to z analytického i ekonomického hlediska, sekvenování nové generace nejlepší volbou.

Introduction, aim: Apical periodontitis (AP) is an inflammatory disease of the dental periradicular tissues caused by a bacterial infection. Various methodological approaches are used to determine the bacteria inhabiting the root canals, however, the analysis of the entire root system of a tooth affected by AP still remains a challenge. The aim of our study was to perform a literature search focused on sample collection procedures and methodologies for bacteriome analysis, and then propose a suitable methodological approach for the purpose of studying the etiopathogenesis of this disease. Methods: After searching the PubMed database, we selected only publications of the original work type in which the bacterial DNA of human teeth was analyzed, for the search. Results: Methodologically, the studies differ greatly, in terms of sample collection, DNA isolation, and bacterial DNA analysis itself. A common method of sample collection is the use of sterile endodontic paper points. Although this method of sampling is suitable in clinical practice, it is considered insufficient for a comprehensive analysis of the environment of the root canal system, due to the morphology of the tooth itself and the presence of ramifications. Another method of sampling is resection of the root tip using sterile burs and subsequent grinding of the apex or smearing with sterile endodontic paper pins. Only the apical part of the tooth is used to determine the bacteriome, therefore bacteria that colonize the coronal part of the tooth and participate in the etiopathogenesis of the disease cannot be analyzed. In recent studies, a method is used in which the entire extracted tooth affected by AP is ground into a fine homogeneous powder using cryogenic grinding. It is possible to determine the complex bacteriome of the root canal system and the pulp chamber from the dust of a crushed tooth, and therefore this method seems optimal for the sample preparation from an experimental study point of view. Most often, an effective column method with various purification kits is used for DNA isolation, and for subsequent DNA analysis, methodologies based on the principle of the polymerase chain reaction are mostly used. Sequencing the variable regions of the gene for 16S rRNA is nowadays already the gold standard for categorizing bacteria and characterizing bacterial communities. Conclusion: To study the AP bacteriome, it seems most appropriate to use extracted tooth samples and immediate freezing of the sample without further pre-analytical steps. The crushed tooth is a suitable matrix for the isolation of microbial DNA with commercially available kits, provided that sterile conditions are maintained during cryogenic grinding. Currently, next-generation sequencing is the best choice for determining the bacteriome and obtaining information about the relative abundance of bacterial genera, both analytically and economically.

Klinika ústní čelistní a obličejové chirurgie Masarykova univerzita Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno

Recetox Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Brno

Stomatologická klinika Masarykova univerzita Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice u sv Anny v Brně

Stomatologická klinika Univerzita Karlova Lékařská fakulta v Hradci Králové a Fakultní nemocnice Hradec Králové

Methodological approaches for the bacteriome analysis of the root canal system of a tooth affected by apical periodontitis