Cíl práce: Ověřit použití komerčně dostupného setu pro rychlou DNA diagnostiku technikou PCR k průkazu komplexu M. tuberculosis v klinickěm materiálu. Metoctika: Bylo vyšetřeno 65 vzorků - 44 (67,7 %) sput a 21 (32,3 %) bronchoalveolárních laváží, resp. bronchiálních aspirátů od nemocných ze spolupracujících pražských plicních a interních klinik. Ze všech vzorků byla vyizolována DNA, amplifikována a amplifikovaný produkt analyzován. Podstatou metody je amplifikace sekvencí DNA specifických pro 65 kDa antigen M. tuberculosis, vymezených 4 primery Mic Tul - Mic Tu4, pomoci tzv. „nested" PCR. Detekce namnoženého úseku DNA byla prováděna v 1,5% agarozovém gelu za přítomnosti ethidiumbromidu. Následovala vizualizace na UV transiluminátoru. Paralelně probíhala přímá mikroskopie a kultivace na pevných a tekutých půdách. Výsledky: Jednotlivé vzorky byly porovnávány s výsledkem pozitivní kontroly, která je součástí setu. Technikou „nested" PCR I bylo M. tuberculosis prokázáno ve 32 (49,2 %) případech, v 8 případech mikroskopicky (12,3 %) a ve 25 případech kultivací (38,5 %). U šesti (9,2 %) vzorků s negativní PCR byly izolovány jiné mykobakteriální druhy - M. gordonae, M. kansasii a M. avium. U sedmi vzorků (10,8 %) bylo M. tuberculosis detekováno pouze pomocí PCR, kultivace i mikroskopie byly negativní. Tento materiál byl opakovaně vyšetřen dalšími amplifikačními technikami (MTD test - Gen - Probe, Inc., San Diego, USA a Amplicor TM - Hoffmann - La Roche, Alameda, USA), u pacientů bylo provedeno i vyšetření sérových protilátek třídy IgG, IgM a IgA a jsou nadále sledováni. U vzorků kultivačně pozitivních nebyl ani v jednom případě zaznamenán negativní výsledek PCR. Senzitivita testu činila 90,3 %, specificita 88,2 %. Závěr: V posledních 10 letech nachází metoda PCR stále častější uplatnění v diagnostice mykobakteriálních infekcí v rutinních laboratořích. Pozornost je soustředěna zvláště na komerčně dostupně, standardizované soupravy umožňující průkaz komplexu M. íufeercu/osis v klinickém materiálu. Vzhledem k výsledkům pilotní studie (vysoká senzitivita a specificita) lze doporučit zkušeným laboratorním pracovníkům (molekulárním biologům) testovanou soupravu k včasné diagnostice tuberkulózy z klinického materiálu.

Objective: Verification of a commercially available kit for rapid DNA diagnostics by the PCR technique in the detection of the M. tuberculosis complex in clinical material. Methods: A total of 65 specimens was examined comprising 44 sputa (67.7 %) and 21 fluids of bronchoalveolar lavages of bronchial aspirates (32.3 %), from patients of cooperating Prague departments of pulmonary diseases and internal medicine. From each specimen DNA was isolated, amplified, and the amplification product was analyzed. The technique is based on amplification of DNA sequences specific for 65 kDa antigen of M. tuberculosis, determined by four primers Mic Tul - Mic Tu4, using the „nested" PCR. The amplified DNA sequence was detected in 1.5% agarose gel in the presence of ethidium bromide and visualized in an UV transilluminator. Specimens were examined in parallel lei by microscopy and cultivation in liquid and solid media. Results: Each specimen was compared with results of a positive control which is in the kit. M. tuberculosis y]2& demonstrated by the „nested" PCR technique in 32 cases (49.2 %), by microscopy in 8 cases (12.3 %), and by cultivation in 25 cases (38.5 %). In 6 PCR-negative specimens (9.2 %) Other species of mycobacteria were isolated, i.e. M. gordonae, M. kansasii, and M. avium. In 7 specimens (10.8 %) M. tuberculosis was detected by PCR only (cultivation and microscopy were negative). These materials were repeatedly examined using other amplification techniques (MTD test - Gen Probe Incs., San Diego and Amplicor™ - Hoffmann - La Roche, Alameda, U.S.A.). The patients were also examined for serum IgC, IgM, and IgA antibodies and are being followed up. All cultivation positive specimens were also PCR-positive. Sensitivity of the test was 90.3 %, and specificity 88.2 %. Conclusions: The PCR technique in the diagnostics of mycobacterial infections in routine laboratories was increasingly implemented during the past ten years. Attention is paticularly focussed on commercially available standartized kits enabling the detection of the M. tuberculosis complex in clinical material. In view of the pilot investigation's results (high sensitivity and specificity) the tested kit can be recommended to experienced laboratory workers (molecular biologists) for early diagnostics of tuberculosis from clinical material.

FNKV 1 int klinika Laboratoř molekulární biologie Praha

Verification of a commercial kit for DNA diagnostics of Mycobacterium tuberculosis in clinical, specimens by the "nested" PCR technique

Ověření použití setu pro DNA diagnostiku M. tuberculosis v klinických vzorcích technikou "nested" PCR = Verification of a commercial kit for DNA diagnostics of Mycobacterium tuberculosis in clinical, specimens by the "nested" PCR technique /

Verification of a commercial kit for DNA diagnostics of Mycobacterium tuberculosis in clinical, specimens by the "nested" PCR technique /

Lit: 24

Souhrn: eng