quantitative real-time PCR Dotaz Zobrazit nápovědu
Real-time PCR je citlivá metoda pro analýzu RNA založená na základě měření fl uorescence. Je využívána v základním výzkumu, molekulární medicíně a v biotechnologiích. Kvantitativní PCR je jednoduchá, s vysokou citlivostí a spolehlivostí. Tato technika se rychle rozvíjí s objevem nových enzymů, chemikálií a přístrojů a slouží mimo jiné k potvrzení dat získaných pomocí sledování genové exprese mikročipovou analýzou. Tato práce seznamuje s principem real-time PCR a popisuje její využití ve studiu mnohočetného myelomu a celkově v hematologii.
Real-time PCR is a sensitive method for RNA analysis based on fl uorescence measurement. It is used in basic research, applied molecular medicine, and biotechnology. Real-time PCR assays are easy to perform and combine high sensitivity with reliability. The technology is evolving rapidly with the introduction of new reagents and instrumentation. It can be used for the confi rmation of data acquired by microarray analysis of gene expression. We review basic principles of real-time PCR and describe its application in hematology and especially in multiple myeloma research.
Cílem předkládané práce je shrnutí výsledků průkazu Bordetella pertussis (BP) a Bordetella parapertussis (BPP) metodou real-time PCR a sérologickými testy. V letech 2008–2010 bylo vyšetřeno na možnou přítomnost onemocnění pertusí 73 pacientů Oddělení klinické imunologie a alergologie Centra imunologie a mikrobiologie ZÚ Ústí nad Labem, vybraných podle kritérií WHO a ECDC, tj. s perzistencí kašle déle než 2 týdny. Přímý průkaz DNA BP a BPP byl proveden soupravou pro real-time PCR z výplachu nosohltanu. Sérologická odpověď byla sledována metodou přímé aglutinace celkových protilátek a stanovením protilátek proti pertusovému toxinu ve třídách IgG, IgA a IgM metodou ELISA. Do souboru pacientů s prokázanou infekcí BP a/nebo BPP bylo zařazeno 42 jedinců rozdělených do dvou skupin: průkaz onemocnění metodou PCR (skupina A, n = 19), průkaz onemocnění pouze sérologickými metodami (skupina B, n = 23), přičemž pacienti ze skupiny A v 10 případech (52,6 %) vykazovali rovněž pozitivitu protilátkové odpovědi. Z našich výsledků je zřejmé, že pertuse by neměla být opomíjenou infekcí. Věříme, že zvýšená informovanost zdravotnické veřejnosti spolu se zkvalitněním laboratorních postupů pomohou v budoucnu odhalit vyšší procento případů nakažených touto, pro řadu lékařů stále ještě vnímanou jako „dětskou“, infekcí.
The goal of this study is to summarize the results of the detection of Bordetella pertussis (BP) and Bordetella parapertussis (BPP) by a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assay and serological methods. In 2008–2010, 73 patients of the Department of Clinical Immunology and Allergology of the Centre for Immunology and Microbiology, Public Health Institute in Ústí nad Labem were screened for pertussis. They were selected according to the WHO and ECDC criteria, i. e. they presented with a persistent cough lasting more than two weeks. Direct detection of BP and BPP DNA from nasopharyngeal wash specimens was performed using a RT PCR assay. The serological responses were evaluated by a direct agglutination test for the detection of total antibodies and by enzyme-linked immunosobent assay (ELISA) for the detection of IgG, IgA, and IgM antibodies against pertussis toxin. Forty-two patients were positive for BP and/or BPP, 19 of them by RT-PCR (group A) and 23 by serology (group B). Ten group A patients (52.6%) were also positive by serology. Our results show that pertussis needs to be a consideration in persistent cough. We believe that increased awareness of the medical community, along with improved laboratory tests will result in increased detection of pertussis that is still considered by many physicians as a childhood infection.
- Klíčová slova
- černý kašel, perzistující kašel,
- MeSH
- aglutinační testy * statistika a číselné údaje MeSH
- Bordetella parapertussis imunologie izolace a purifikace MeSH
- Bordetella pertussis imunologie izolace a purifikace MeSH
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- ELISA statistika a číselné údaje MeSH
- kašel etiologie MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce * statistika a číselné údaje MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- následné studie MeSH
- pertuse * diagnóza epidemiologie imunologie MeSH
- pertusový toxin imunologie MeSH
- předškolní dítě MeSH
- reagenční diagnostické soupravy MeSH
- rodina MeSH
- senioři MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- zdraví rodiny MeSH
- Check Tag
- dítě MeSH
- dospělí MeSH
- lidé středního věku MeSH
- lidé MeSH
- mladiství MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- předškolní dítě MeSH
- senioři MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Východisko. Molekulárně biologické metody založené na reverzní transkripci a následné polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) jsou schopny detekovat přítomnost transkriptu BCR-ABL u chronické myeloidní leukémie (CML). V tomto sdělení prezentujeme naše zkušenosti se sledováním reziduální leukémie metodou real-time PCR s detekcí hybridizačními sondami u nemocných s CML léčených imatinibem a při sběru periferních krvetvorných buněk (PKB). Metody a výsledky. Stanovení hladin transkriptu BCR-ABL v periferní krvi bylo provedeno u 27 osob před nasazením a v průběhu léčby imatinibem mesylátem. Medián relativního množství BCR-ABL v periferní krvi před nasazením imatinibu byl 2,55 %. Množství transkriptu u 23 osob bez rezistence vůči imatinibu pokleslo během prvních šesti měsíců léčby na hodnotu 0,02 %. Po dvanáctiměsíční léčbě poklesl medián množství transkriptu na 0,005 %. V dalším průběhu léčby hladiny BCR-ABL kolísaly mezi hodnotami pod detekčním limitem metody (0,001 %) a 0,005 %. Tři pacienti byli vůči imatinibu primárně rezistentní s rozsahem hodnot od 0,13 % do 11,7 %. Jeden pacient vykazoval po 18 měsících léčby známky molekulárního relapsu. Z 16 pacientů po stimulaci PKB filgrastimem měly pouze dvě vyšetřované osoby hodnoty BCR-ABL v periferní krvi i v PKB pod detekčním limitem použité metody. U ostatních osob se koncentrace fúzního transkriptu pohybovala v koncentracích spolehlivě stanovitelných metodou RT-PCR. Závěry. Vzhledem k svému prognostickému významu je vyšetření BCR-ABL vhodné pro monitorování kinetiky reziduální choroby. Stanovení provedené v koncentrátu PKB jako potenciálním autotransplantátu může kompletovat informace o kvalitě těchto buněk z hlediska proporce BCR-ABL transkriptu a nastínit další možné terapeutické postupy a prognózu pacienta.
Background. Molecular biology methods based on reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) are able to detect the presence of BCR-ABL transcripts in chronic myeloid leukemia (CML). In this study we present our experience with monitoring of residual disease using real-time PCR with hybridization probes detection in patients treated with imatinib mesylate and in collected peripheral blood progenitor cells (PBPC). Methods and Results.We measured the level of BCR-ABL transcripts in peripheral blood cells of 27 subjects before and in the course of the imatinib treatment. The median of relative quantity of BCR-ABL in the blood before imatinib therapy was 2.55%. The number of the transcripts in 23 imatinib-sensitive subjects decreased to 0.02% in 6 months. After 12 months of the treatment the BCR-ABL median was 0.005%. Subsequent levels fluctuated between values below the detection limit (DL, 0.001%) and 0.005%. Three patients were primarily resistant to imatinib with the BCR-ABL range of 0.13%-11,7% during the treatment. One subject showed marks of molecular relapse after 18 months of the treatment. Only two of 16 filgrastim-stimulated patients had BCR-ABL levels in the blood and in collected PBPC below DL. In other subjects BCR-ABL transcripts were determined within the measurable range of RT-PCR. Conclusions. Taking into account prognostic importance, the measurement of BCR-ABL transcripts is an effective approach to monitoring of residual CML kinetics. Evaluation of BCR-ABL levels in collected PBPC can complete information on quality of the cells in potential autotransplants, and choose subsequent therapeutic protocols and patient prognosis.
- MeSH
- bcr-abl fúzní proteiny krev MeSH
- chemorezistence MeSH
- chronická myeloidní leukemie diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- faktor stimulující kolonie granulocytů aplikace a dávkování MeSH
- imatinib mesylát MeSH
- lidé MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody MeSH
- prognóza MeSH
- protinádorové látky aplikace a dávkování farmakologie MeSH
- reziduální nádor diagnóza farmakoterapie genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- mužské pohlaví MeSH
- ženské pohlaví MeSH
Cíl: Zavedení, charakterizace a porovnaní dvou metod kvantitativního stanovení viru hepatitidy B-HBV DNA. Obě metody používají totožného principu měření na bázi reál time PCR. První z nich je prováděna pomocí analytického systému LightCycler Roche Diagnostics a druhá na přístroji Rotorgene Corbett Research. Předmětem porovnávání metod byla linearita a pracovní rozsah stanovení, mez detekce, klinická senzitivita a specifičnost obou metod a jejich diagnostická správnost. Materiál: Oběma metodami bylo simultánně analyzováno 68 sér pacientů s diagnostikovanou chronickou hepatitidou B v různých fázích choroby. Výsledky: Regresní analýzou jsme stanovili hodnotu korelačního koeficientu r= 0,995 (p < 0,0001), potvrzující velmi úzký vztah mezi souborem výsledků získaných oběma metodami. Přesnost měření obou metod nepřekračuje hodnotu CV = 15 %. Obě metody disponují vysokým rozsahem linearity měření v intervalu lO 3-lO 8 kopií HBV DNA/ml. Diagnostická správnost srovnávaných metod byla vyhodnocena ROC analýzou. Pro obě metody byla zjištěna hodnota klinické sensitivity 100 %, klinická specifičnost metody LightCycler činila 96 % ve srovnání s 95 % u metody Rotorgene. Klinická efektivita, vyjádřená hodnotou AUC (plochy pod krivkou) byla 0,995 (LightCycler) respektive 0,994 (Rotorgene). Metoda LightCycler vykázala vyšší hodnotu pozitivního pravděpodobnostního poměru + LR = 26 oproti hodnotě 19,5 u Rotorgenu. Závěr: Uvedené údaje vypovídají o velmi vysoké hodnotě klinické užitečnosti obou metod.
Objective: Introduce, characterize and compare two methods of hepatitis virus B DNA quantification in serum. Both methods are based on real time PCR principle. Two measurement systems, LightCycler Roche and Rotorgene Corbett Research were used. We evaluated and compared their precision, linearity, limit of detection, clinical sensitivity, clinical specificity and diagnostic accuracy. Materials: By use of mentioned methods we analysed 68 sera from patients with diagnosed chronic hepatitis B in different stages of disease. Results: Correlation coefficient 0,995 (p < 0,0001) obtained by linear regression analysis shows excellent relationship between results of evaluated methods. The coefficients of variation for repeatability and reproducibility indicate very good measurement precision and are in all cases lower than 15 %. Linearity of both methods has very broad range lO 3 -lO 8copies of HBV DNA/ml. It means that majority of samples may be analysed without repeating after sample dilution. By use of ROC analysis we determined AUC value 0,995, clinical sensitivity 100 %, specificity 96 % and positive likelihood ratio (+LR) 26,0 for LightCycler, resp. AUC = 0,994, specificity 95 %, +LR = 19,5 for Rotorgene. Conclusion: All analytical and clinical characteristics of introduced methods show their usefulness for diagnosis and treatment of chronic hepatitis B.
An introduction to real-time PCR / N. A. Saunders -- Ch. 2. An overview of real-time PCR platforms / J. M. J. Logan and K. J. Edwards -- Ch. 3. Performing real-time PCR / K. J. Edwards -- Ch. 5. Quantitative real-time PCR / N. A. Saunders -- Ch. 7. Mutation detection by real-time PCR / K. J. Edwards and J. M. J. Logan -- Ch. 9.
vi, 346 s. : il. ; 25 cm
- MeSH
- amplifikace genu MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody trendy MeSH
- Publikační typ
- monografie MeSH
- Konspekt
- Biochemie. Molekulární biologie. Biofyzika
- NLK Obory
- biologie
Cíl práce: Navržení a validace real-time PCR, vhodné pro kvantitativní průkaz C. pneumoniae a C. trachomatis v klinických vzorcích. Materiál a metody: Jako cílový úsek pro amplifikaci byla zvolena část genu pro 16S RNA. Pomocí klonování produktu reakce v bakteriálním plazmidu byl připraven rekombinantní kalibrátor a kombinovaný interní standard, který lze použít ve třech různých PCR. Pro validaci byly použity archivované izoláty DNA z různých klinických vzorků, izoláty DNA z dalších infekčních agens a kontrolní vzorky pro detekci DNA CT (QCMD) a CPN (Instand). Výsledky: Byla ověřena specificita a reprodukovatelnost reakce. Analytická citlivost byla stanovena na 5–10 kopií bakteriálního genomu/reakci. 105 izolátů DNA z různých typů klinických vzorků (výtěry, moče, periferní krev, BAL) bylo vyšetřeno pomocí real-time PCR a konvenční PCR. Vzorky, které poskytly nesouhlasný výsledek, byly charakterizovány pomocí třetího nezávislého amplifikačního testu. Citlivost a specificita real-time PCR byla 89 % a 100 %. Metoda je vhodná pro screening i diagnostiku chlamydií.
Study objective: Design and validation of a real-time PCR assay for quantitative detection of C. pneumoniae and C. trachomatis in clinical specimens. Material and Methods: A part of the 16S RNA gene was selected as the target sequence for amplification. The reaction product was cloned in the bacterial plasmid and a recombinant calibrator and a combined internal standard were prepared, usable in three different PCR assays. Archived DNA isolates from various clinical specimens, DNA isolates from other infectious agents and control samples for DNA detection, CT (QCMD) and CPN (Instand), were used for validation. Results: Reaction specificity and reproducibility were tested. The analytical sensitivity was set to 5–10 copies of the bacterial genome/reaction. As many as 105 DNA isolates from various types of clinical specimens (swabs, urine, peripheral blood and BAL fluid) were tested by real-time PCR and conventional PCR assays. The specimens that had not yielded concordant results were characterized by a third independent amplification test. The sensitivity and specificity of real-time PCR were 89 % and 100 %, respectively. The assay is suitable for both screening and diagnosis of Chlamydia.
- MeSH
- Chlamydia trachomatis genetika imunologie izolace a purifikace MeSH
- Chlamydophila pneumoniae genetika imunologie izolace a purifikace MeSH
- financování organizované MeSH
- genetické testování metody využití MeSH
- lidé MeSH
- mikrobiologické techniky metody využití MeSH
- polymerázová řetězová reakce metody využití MeSH
- sekvenční analýza DNA metody využití MeSH
- senzitivita a specificita MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
The environment is a reservoir of nontuberculous mycobacteria and is considered a source of infection for animals and humans. Mycobacteria can persist in different types of environments for a relatively long time. We have studied their possible internalization into plant tissue through intact, as well as damaged, root systems of different types of plants grown in vitro and under field conditions. The substrate into which plants were seeded was previously contaminated with different strains of Mycobacterium avium (10(8) to 10(10) cells/g of soil) and feces from animals with paratuberculosis. We detected M. avium subsp. avium, hominissuis, and paratuberculosis in the stems and leaves of the plants by both culture and real-time quantitative PCR. The presence of mycobacteria in the plant tissues was confirmed by microscopy. The concentration of mycobacteria found inside plant tissue was several orders of magnitude lower (up to 10(4) cells/g of tissue) than the initial concentration of mycobacteria present in the culture medium or substrate. These findings led us to the hypothesis that plants may play a role in the spread and transmission of mycobacteria to other organisms in the environment.
- MeSH
- bakteriologické techniky MeSH
- endocytóza * MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
- listy rostlin mikrobiologie MeSH
- mikroskopie MeSH
- Mycobacterium genetika růst a vývoj fyziologie MeSH
- rostliny mikrobiologie MeSH
- stonky rostlin mikrobiologie MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Real-time PCR je metoda, která se používá pro sledování hromadění produktů polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Je schopna detekovat již minimální množství nukleových kyselin s vysokou přesností a citlivostí. Tato technika se v laboratoři uplatňuje jak při stanovení diagnózy, tak ve výzkumu. V diagnostice umožňuje kvantitativní PCR detekci genů, které se hrají roli v rozvoji infekčního onemocnění, nádorů a genetických abnormalit. Ve výzkumu umožňuje metoda vysoce citlivé kvantitativní měření genové transkripce. V laboratoři může být použita pro stanovení změn genové exprese určitého genu v čase jako odpověď buněk po podání léku, v diferenciaci buněk nebo jako reakce na změnu podmínek prostředí. Tato práce se zaměřuje na využití real-time PCR při studiu mnohočetného myelomu.
Real-time PCR is a method used to monitor the amplifi cation of polymerase chain reaction products in real time. It is able to detect minimal amounts of nucleic acid with high specifi city and sensitivity. This technique is used both for diagnostic and research applications. Diagnostic real-time PCR enables the detection of genes involved in infectious diseases, cancer and genetic abnormalities. In the research setting, real-time PCR is used to provide highly sensitive quantitative measurements of gene transcription. The technique may be used to determine the genetic expression of a particular gene and its changes over time, e.g. in the analysis of cellular response to a therapeutic agent or to changes in the microenvironment, or to assess the progression of cell differentiation.
- MeSH
- antigeny nádorové MeSH
- kvantitativní polymerázová řetězová reakce * MeSH
- lidé MeSH
- mnohočetný myelom * genetika MeSH
- P-glykoprotein genetika MeSH
- prognóza MeSH
- výzkum MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Here we report one of the smallest real-time polymerase chain reaction (PCR) systems to date with an approximate size of 100 mm × 60 mm × 33 mm. The system is an autonomous unit requiring an external 12 V power supply. Four simultaneous reactions are performed in the form of virtual reaction chambers (VRCs) where a ≈200 nL sample is covered with mineral oil and placed on a glass cover slip. Fast, 40 cycle amplification of an amplicon from the H7N9 gene was used to demonstrate the PCR performance. The standard curve slope was -3.02 ± 0.16 cycles at threshold per decade (mean ± standard deviation) corresponding to an amplification efficiency of 0.91 ± 0.05 per cycle (mean ± standard deviation). The PCR device was capable of detecting a single deoxyribonucleic acid (DNA) copy. These results further suggest that our handheld PCR device may have broad, technologically-relevant applications extending to rapid detection of infectious diseases in small clinics.
The invention of polymerase chain reaction (PCR) in 1983 revolutionized many areas of science, due to its ability to multiply a number of copies of DNA sequences (known as amplicons). Here we report on a method to double the throughput of quantitative PCR which could be especially useful for PCR-based mass screening. We concurrently amplified two target genes using only single fluorescent dye. A FAM probe labelled olionucleotide was attached to a quencher for one amplicon while the second one was without a probe. The PCR was performed in the presence of the intercalating dye SYBR Green I. We collected the fluorescence amplitude at two points per PCR cycle, at the denaturation and extension steps. The signal at denaturation is related only to the amplicon with the FAM probe while the amplitude at the extension contained information from both amplicons. We thus detected two genes within the same well using a single fluorescent channel. Any commercial real-time PCR systems can use this method doubling the number of detected genes. The method can be used for absolute quantification of DNA using a known concentration of housekeeping gene at one fluorescent channel.
