Východisko. Dynamické mutace lidského genomu jsou novou třídou genových mutací, reprezentovaných nestabilním počtem trinukleotidových opakování, způsobující závažná dědičná neuromuskulární a neurodegenerativní onemocnění u lidí. Identifikace patologických expandovaných alel na molekulární úrovni je důležitá pro klinickou diagnózu. Metody a výsledky. Pro molekulární diagnostiku expandovaných tandemových repeticí trinukleotidových sekvencí jsme zavedli efektivní TP-PCR metodu podleWarnera et al. (13). Pro rychlou detekci expandovaných CTG alel genu DMPK (myotonická dystrofie –MD) jsme tutometodu modifikovali do dvoufázového protokolu; nejprve byly pomocí PCR selektovány vzorky DNA heterozygotů s využitím primerů P1 a P2, ohraničujících trakt s repeticemi, druhé vyšetření metodou TP-PCR bylo zaměřeno především na identifikaci patologické alely. Fluorescenčně značený specifický primer v TP-PCR byl použit pro přesné určení počtu CAGopakování v genu IT-15 (Huntingtonova choroba – HD) v diagnosticky důležité oblasti šedé zóny (rozmezí 35–39 CAG). Reprodukovatelnost výsledků PCR byla ověřena na kontrolních vzorcích DNA o známém genotypu a v případě MD také Southernovou hybridizací. Zejména jsme ukázalimožnost levnějšího PCR-P1/P2 a TP-PCR protokolu, který využívá barvení PCRproduktů separovaných na polyakrylamidových gelech stříbrem. Závěr. Naše zkušenosti se zavedenímvýše uvedených PCRmetod do laboratorní praxe dokumentují obecnémožnosti jejich významného uplatnění pro molekulární diagnostiku dědičných chorob charakterizovaných nestabilitou v trinukleotidových traktech.

Background. Human genome dynamic mutations are a new class of gene mutations represented by an unstable number of trinucleotide repeats and causing severe human hereditary neuromuscular and neurodegenerative diseases. The identification of pathological expanded alleles on the molecular level is important for clinical diagnostics. Methods and Results. For the molecular diagnostics of expanded tandem repeat trinucleotide sequences we have introduced a fast and efficient TP-PCR fluorescent method according toWarner et al. (1996).We have modified this TP-PCR method for a rapid detection of expanded CTG alleles of the DMPK gene (myotonic dystrophy, MD) into a two-level protocol; first, the heterozygote sample DNAs were selected using P1/P2 primers flanking repeat tracts and, second, the TP-PCR protocol used was focused above all on the identification of a pathological allele. A fluorescent-labelled specific primer in TP-PCR was used for the exact determination of the number of CAG repeats of the gene IT-15 (Huntington’s disease – HD) in the diagnostically important region of the grey zone (35 to 39 CAG). The reproducibility of the PCR results was demonstrated on control DNA samples with the known genotype and, in the case of MD, also by Southern blot analysis. We have especially shown the possibility of a cheaper PCR-P1/P2 and TP-PCR protocol, which can be used, with silver staining of separated PCR products on polyacrylamide gels. Conclusions. Our experience with introducing the above-mentioned PCR methods into laboratory practice clearly documents the possibilities of their general applicability in the molecular diagnostics of hereditary diseases characterised by instability of the trinucleotide repeat tracts.

Biofyzikální ústav AV ČR Brno

Methodological possibilities for the determination of the number of CTG/CAG repeats in triplet repeat units of the human genome

Metodické možnosti stanovení počtu CTG/CAG opakování v trinukleotidových repeticích lidského genomu = Methodological possibilities for the determination of the number of CTG/CAG repeats in triplet repeat units of the human genome /

Methodological possibilities for the determination of the number of CTG/CAG repeats in triplet repeat units of the human genome /

Lit: 23

Souhrn: eng