Nejvýznamnějším zdrojem extracelulárních fetálních nukleových kyselin (DNA a RNA) pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky jsou apoptotická tělíska trofoblastu. V této práci jsme se zaměřili na studium fragmentace extracelulární DNA přítomné v mateřské cirkulaci u 6 těhotných žen v 16. týdnu gravidity. Fragmentovaná extracelulární DNA byla separována podle délky jednotlivých fragmentů metodou gelové elektroforézy a v jednotlivých sekcích o molekulové hmotnosti 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp byla stanovena koncentrace fetální a celkové směsné DNA pomocí PCR v reálném čase s využitím specifických primerů a TaqMan sond pro SRY a GLO geny. Fetální DNA byla detekována pouze ve fragmentech o molekulové hmotnosti 100–300 bp a 300–500 bp. Největší koncentrace fetální DNA se vyskytovala v sekci o molekulové hmotnosti 100–300 bp, kde dosáhla hodnot 14,8 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 1,56–83,2). V sekci o molekulové hmotnosti 300–500 bp bylo detekováno menší množství fetální DNA o koncentracích 1,53 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 0–10,8). V sekcích o molekulové hmotnosti 500–700 bp, 700–900 bp a > 900 bp nebyla fetální DNA detekována. Fetální DNA byla ve frakci o molekulové hmotnosti 100–300 bp 4,8násobně zkoncentrována (rozpětí 0krát–16,6krát) ve srovnání s fetální DNA přítomnou v neseparované extracelulární DNA, která se po izolaci z mateřské plazmy používá pro detekci paternálních alel u plodu. Pokud se zaměříme na izolaci DNA o velikosti fragmentů 100–300 bp, získáme koncentrovanější ale nikoliv purifikovanou fetální DNA. Obsah fetální DNA v této frakci činil 1,15 % (rozpětí 0,16–8,0) ve srovnání s neseparovanou extracelulární DNA, kde podíl fetální DNA tvořil pouze 0,29 % (rozpětí 0,06–1,78). Z naší studie je zřejmé, že metoda koncentrace fetální DNA pomocí separace fragmentované extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy prostřednictvím gelové elektroforézy není vhodná pro rutinní účely.

Apoptotic bodies derived from placental trophoblasts represent the most important source of extracellular fetal nucleic acids (DNA and RNA) for the purpose of non-invasive prenatal diagnosis. In this work we studied the fragmentation of extracellular DNA present in maternal circulation of 6 pregnant women within 16th week of gestation. Extracellular DNA was separated by using agarose gel electrophoresis size-fractionation. Fetal and total circulatory DNA was quantified in individual fractions with an approximate size of 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp by using real-time PCR, specific primers and TaqMan probes for SRY and GLO genes. Fetal circulatory DNA was mainly detected in section with a size 100–300 bp with the concentration of 14.8 GE/ml (range 1.56–83.2). Lower amount of fetal circulatory DNA, 1.53 GE /ml (range 0–10.8), was also found in a fraction with a size 300–500 bp. No fetal DNA was detected in fractions with an approximate size of 500–700 bp, 700–900 bp and more than 900 bp. Circulatory DNA extracted from the gel fragment with a molecular size less than 300 bp contained 4.8 x (range 0x–16.6x) enriched fetal DNA when compared with initial unseparated DNA sample, which has been usually used to detect fetal paternally inherited alleles. If we focused on isolation of DNA with a size of 100–300 bp, we could get more concentrated but not purified fetal DNA. The median percentage of foetal derived DNA in this fraction was 1.15 % (range 0.16–8.0). However median percentage of fetal derived DNA in unseparated extracellular DNA was 0.29 % (range 0.06–1.78). Our experience revealed that the usage of enriched size-fractionated fetal DNA is not suitable for routine clinical applications.

Laboratoř buněčné biologie Pediatrická klinika 2 LF UK a FNM Praha

Non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood is performed on fractionated extracellular fetal DNA with size < 500 bp

Neinvazivní prenatální diagnostika z periferní krve matky je prováděna na fragmentované extracelulární fetální DNA o velikosti 500 bp = Non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood is performed on fractionated extracellular fetal DNA with size < 500 bp /

Non-invasive prenatal diagnosis from maternal peripheral blood is performed on fractionated extracellular fetal DNA with size < 500 bp /

Lit. 19