Cíle studie: Cílem této práce bylo nalézt dostatečně účinnou metodu pro izolaci fungální DNA z periferní krve, která by svým provedením (zejména časovou a finanční nenáročností) byla vhodná pro rutinní diagnostické použití. Materiál a metody: Srovnávali jsme čtyři různé metody izolace fungální DNA – jednu metodu založenou na enzymatické lyzi buněk a tři různé metody využívající spojení chemické lyze a mechanického rozrušení fungálních buněk pomocí skleněných kuliček. Pro izolaci byla použita tzv. negativní periferní krev (tedy periferní krev pacientů bez příznaků a průkazu infekce Aspergillus sp.) zaočkovaná definovaným množstvím kultury Aspergillus sp. Izolovaná DNA byla poté kvantitativně analyzována pomocí in-house real-time PCR metody se specifickou sondou. Výsledky: Enzymatická metoda se pro použití v rutinní diagnostice zdá být svou nízkou účinností a také zdlouhavým provedením naprosto nevhodná. Naopak vhodnější mohou být metody využívající spojení chemického a mechanického rozrušení buněk s jejichž pomocí je možné izolovat fungální DNA s vysokou účinností v poměrně krátkém čase. Závěr: Pro rutinní použití byla v naší laboratoři vybrána metoda izolace fungální DNA pomocí ZR Fungal/Bacterial DNA Kit (Zymo Research, USA), kterou je nyní zapotřebí vyzkoušet na větším množství skutečných klinických vzorků.

Aim of the study: The main goal of this study was to find the best method for fungal DNA isolation from peripheral blood samples. The method should be very effective but not expensive or time consuming to be suitable for routine diagnostics use. Material and methods: We compared four different methods for Aspergillus DNA isolation - one method with enzymatic lysis of the fungal cell wall and three methods that combine chemical and mechanical lysis (using high speed cell disruption with glass beads). Negative peripheral blood samples (peripheral blood of patients without symptoms and confirmation of Aspergillus infection) inoculated with defined amount of Aspergillus sp. hyphae were used for DNA isolation. Isolated DNA was then quantitatively analyzed with in-house real-time PCR method using specific probe. Results: Enzymatic method seems not to be useful in a routine diagnostics mainly because of its low efficiency and too long processing time. Better could be the methods using both chemical and mechanical cell disruption that can isolate fungal DNA with high efficiency in a relatively short time. Conclusions: The method using ZR Fungal/Bacterial DNA Kit (Zymo Research, USA) was chosen for routine use in our laboratory. It is necessary to test this method on more clinical samples to evaluate its contribution to molecular diagnostics of invasive aspergillosis.

Centrum molekulární biologir a genové terapie Interní hematoonkologická klinika FN Brno

Lit.: 33