V poslední době se v experimentální praxi stále ve větší míře uplatňují metody využívající mikročipové expresní analýzy. Většina expresních analýz v medicínském výzkumu vychází z bioptických vzorků, které obsahují řadu různých typů buněk. Majoritní populace buněk je určující pro celkovou informaci o genové expresi a znemožňuje tak rozlišení specifické genové exprese jednotlivých typů buněk. Mezi metody, které umožňují selekci přesně definovaných populací buněk patří laserová a mechanická mikrodisekce. Současné čipy vyžadují mikrogramová množství značené nukleové kyseliny, přičemž vstupní množství RNA ze selektovaných buněk se může pohybovat pouze v nanogramovém až pikogramovém řádu. Tento problém je možno řešit různými způsoby amplifikace RNA, mezi které patří dvojitá lineární amplifikace RNA nebo metody využívající kombinovanou PCR s linearní amplifikací. V tomto krátkém přehledu poskytujeme jednak informace, se kterými jsme se setkali jednak během naší současné analýzy genové exprese v mikrodisekovaných buňkách mléčné žlázy, a také náš optimalizovaný postup. Celý projekt sestával z časově náročného sběru čerstvě zmražené tkáně, optimalizace přípravy kryofiezů pro mikrodisekci, izolace a amplifikace RNA, hybridizace na mikročipy, analýzy dat a konečně verifikace vybraných výsledků pomocí imunohistochemie. V současné době je vlastní práce v oponentním řízení v zahraničním časopise, a nemůžeme proto poskytnou detailnější informace o získaných výsledcích.

The DNA microarray is a powerful, high throughput technique for assessing gene expression on a systemwide genomic scale. Most expression profiling studies of solid tumors have used biopsy samples containing large numbers of contaminating stromal and other cell types, thereby complicating any precise delineation of gene expression in nontumor versus tumor cell types. Combining microdissection, RNA amplification protocols, microarray technologies and our knowledge of the human genome sequence, it is possible to isolate pure populations of cells or even a single cell and interrogate the expression of thousands of sequences for the purpose of more precisely defining the biology of the tumor cell. In this short overview, we provide informations on selected problems which we had to solve during our microarray analysis of microdissected normal and tumour cells of mammary gland. We provide our optimized procedure as well. The whole project consisted of the long-term collection of snap-frozen tissues, optimalization of staining of cryosections for laser capture microdissection, isolation and amplification of RNA, hybridization onto chips, data analysis and finally verification of the results by immunohistochemistry. Our work is currently reviewed by an international journal and we can’t provide detailed information on particular achievements yet.

Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc

Microarray analysis of gene expressionm in microdissected samples

Čipové technologie v onkologickém výzkumu a praxi

Lit.: 30