Komplex vyvíjejícího se zubu a okolních struktur zahrnuje řadu typů diferencovaných buněk. Ty se často vyskytujíve velmi malých počtech, ale mají velký biologický význam v morfogenezi (např. signální centra sklovinných uzlů). Možnost izolace homogenních vzorků z konkrétních tkáňově vázaných buněčných populací byla dlouhou dobu omezena. Nová technologie systému laserové záchytové mikrodisekce (LCM) zprostředkovává řadu přesných výzkumů na buněčné a subbuněčné úrovni. V posledním desetiletí bylo techniky LCM využito také pro některé studie zaměřené na mechanismy vývoje zubů a související poruchy. Cílem tohoto článkuje stručné shrnutí přístupu LCM, jeho aplikací ve výzkumu odontogeneze i nejaktuálnějších modifikací kombinujících LCM a průtokovou cytometrii pro analýzy jednotlivých buněk na úrovni nukleových kyselin a proteinů.
Complex of developing tooth and surrounding structures comprises several types of differentiated cells. They often occur in very small numbers but with a high biological impact on morphogenesis (e. g. signalling centres of enamel knots). However, isolation of specific homogenous samples from distinct tissue bound cell populations was long time limited. With appearance of novel technologies, the laser capture microdissection (LCM) system mediates many exact investigations at the cellular and subcellular level. In the last decade, the LCM technique has been used also for several studies focused on mechanisms of tooth development and related disorders. This paper aims to briefly review the LCM approach, its application in odontogenesis research, and the most recent modification combining LCM and flow cytometry for single cell analysis at nucleid acid and protein levels.
Laserová záchytná mikrodisekce (Laser capture microdissection, LCM) je rychlá a spolehlivá metoda, která umožňuje izolaci cílových buněk ze specifického komplexu tkáně pro jejich následnou molekulární nebo proteinovou analýzu. Základem LCM je inverzní mikroskop se zabudovaným nízkovýkonnostním infračerveným laserem. Nařezané tkáně jsou upevněny na standardní podložní sklo a termoplastická membrána (TM) je umístuna nad dehydratovaný preparát. V ohnisku laserového mikroskopu je umístněna TM, kterou laser roztaví v požadovaném místě a naváže tak cílovou buňku či strukturu k membráně. V současné době máme k dispozici několik laserových mikrodisekčních systémů, které se liší způsobem zachycení disekovaných buněk, v konfiguraci systému i v jednotlivých aplikacích. Laserovou mikrodisekci lze použít pro izolaci buněk u řady typů buněčných i tkáňových preparátů, včetně zamražených vzorků, formalínem fixovaných parafinizovaných tkání či cytologických preparátů. V závislosti na použitém materiálu je možno z mikrodisekovaných buněk extrahovat DNA, RNA či proteiny v dobré kvalitě. Kombinací s dalšími technikami, jako je například cDNA microarray, LCM pomáhá identifikovat nové diagnostické a prognostické znaky vedoucí ke zlepšení diagnosticko terapeutických metod v léčbě onkologických onemocnění. Na našem pracovišti jsme laserovou mikrodisekcí izolovali buňky z cytologických preparátů adenokarcinomu plic získaných punkční cytologií zmražených či parafinizovaných nádorů a také buněčné linie, např. myeloidní leukemii K562. V této práci popisujeme naše zkušenosti se zavedením LCM s následnou mikroizolací DNA/RNA a lineární amplifikací DNA/RNA pro účely dalších genetických analýz jako je např. komparativní genomická hybridizace, expresní studie, či přímé sekvenování vyšetřovaných genů z biologického materiálu s minimálním obsahem nádorových buněk, či pro studium nádorové heterogenity na jednobuněčné úrovni.
Laser capture microdissection (LCM) is a rapid, reliable method to obtain pure populations of targeted cells from specific microscopic regions of tissue sections for subsequent analysis. LCM is based on the adherence of visually selected cells to a thermoplastic membrane, which overlies the dehydrated tissue section and is focally melted by triggering of a low energy infrared laser pulse. Tissue sections are mounted on standard glass slides, and transparent thermoplastic membrane is then placed over the dry section. The laser provides enough energy to transiently melt this thermoplastic film in to the target cells. Several systems are available for LCM, and vary in cell-capture method, system configuration and applications. LCM was applied to a wide range of cell and tissue preparations including frozen samples, formalin-fixed paraffin-embedded tissues or cytology smears. Depending on the starting material, DNA, good quality mRNA, and proteins can by extracted successfully from captured tissue fragments, down to the single cell level. In combination with another techniques like expression library construction and cDNA array hybridisation, LCM will allow the establishment of new diagnostic and prognostic markers, in order to indicate therapy individually tailored to the molecular profile of a given tumour. In this paper we refer our experiences with the LCM isolation of single cells from cytology smears of lung carcinomas, frozen and paraffin embedded tumour tissues as well as cell line cytospin preparation. Our ultimate goal was to introduce LCM technology in combination with DNA/RNA isolation and linear amplification for subsequent genomic analyses such as comparative genomic hybridisation, RNA expression studies and specific amplifications of investigated genes from tissue specimens with minority of tumour cells and/or for tumour heterogeneity studies based on one the single cell level.
- MeSH
- erbB receptory genetika izolace a purifikace MeSH
- financování organizované MeSH
- geny erbB-1 genetika MeSH
- geny ras genetika MeSH
- hybridizace genetická MeSH
- lasery využití MeSH
- lékařská onkologie metody trendy MeSH
- lidé MeSH
- mikrodisekce metody přístrojové vybavení využití MeSH
- odběr biologického vzorku metody využití MeSH
- srovnávací genomová hybridizace MeSH
- techniky amplifikace nukleových kyselin metody přístrojové vybavení využití MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
V poslední době se v experimentální praxi stále ve větší míře uplatňují metody využívající mikročipové expresní analýzy. Většina expresních analýz v medicínském výzkumu vychází z bioptických vzorků, které obsahují řadu různých typů buněk. Majoritní populace buněk je určující pro celkovou informaci o genové expresi a znemožňuje tak rozlišení specifické genové exprese jednotlivých typů buněk. Mezi metody, které umožňují selekci přesně definovaných populací buněk patří laserová a mechanická mikrodisekce. Současné čipy vyžadují mikrogramová množství značené nukleové kyseliny, přičemž vstupní množství RNA ze selektovaných buněk se může pohybovat pouze v nanogramovém až pikogramovém řádu. Tento problém je možno řešit různými způsoby amplifikace RNA, mezi které patří dvojitá lineární amplifikace RNA nebo metody využívající kombinovanou PCR s linearní amplifikací. V tomto krátkém přehledu poskytujeme jednak informace, se kterými jsme se setkali jednak během naší současné analýzy genové exprese v mikrodisekovaných buňkách mléčné žlázy, a také náš optimalizovaný postup. Celý projekt sestával z časově náročného sběru čerstvě zmražené tkáně, optimalizace přípravy kryofiezů pro mikrodisekci, izolace a amplifikace RNA, hybridizace na mikročipy, analýzy dat a konečně verifikace vybraných výsledků pomocí imunohistochemie. V současné době je vlastní práce v oponentním řízení v zahraničním časopise, a nemůžeme proto poskytnou detailnější informace o získaných výsledcích.
The DNA microarray is a powerful, high throughput technique for assessing gene expression on a systemwide genomic scale. Most expression profiling studies of solid tumors have used biopsy samples containing large numbers of contaminating stromal and other cell types, thereby complicating any precise delineation of gene expression in nontumor versus tumor cell types. Combining microdissection, RNA amplification protocols, microarray technologies and our knowledge of the human genome sequence, it is possible to isolate pure populations of cells or even a single cell and interrogate the expression of thousands of sequences for the purpose of more precisely defining the biology of the tumor cell. In this short overview, we provide informations on selected problems which we had to solve during our microarray analysis of microdissected normal and tumour cells of mammary gland. We provide our optimized procedure as well. The whole project consisted of the long-term collection of snap-frozen tissues, optimalization of staining of cryosections for laser capture microdissection, isolation and amplification of RNA, hybridization onto chips, data analysis and finally verification of the results by immunohistochemistry. Our work is currently reviewed by an international journal and we can’t provide detailed information on particular achievements yet.
- MeSH
- čipová analýza proteinů metody přístrojové vybavení využití MeSH
- exprese genu genetika MeSH
- financování organizované MeSH
- imunohistochemie využití MeSH
- lasery využití MeSH
- lidé MeSH
- mikrodisekce metody přístrojové vybavení využití MeSH
- mléčné žlázy lidské cytologie MeSH
- odběr biologického vzorku metody trendy MeSH
- polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody přístrojové vybavení využití MeSH
- RNA diagnostické užití genetika izolace a purifikace MeSH
- techniky amplifikace nukleových kyselin metody přístrojové vybavení využití MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
