• MeSH
• biologické markery analýza   MeSH
• DNA analýza   diagnostické užití   MeSH
• hepatitida B diagnóza   genetika   MeSH
• hepatitida C diagnóza   genetika   MeSH
• laboratoře statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• lidé MeSH
• řízení kvality MeSH
• RNA analýza   diagnostické užití   genetika   MeSH
• sérologické testy statistika a číselné údaje   využití   MeSH
• statistika jako téma MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• DNA diagnostické užití   genetika   MeSH
• financování organizované MeSH
• genetické služby využití   MeSH
• lidé MeSH
• mykózy diagnóza   etiologie   genetika   MeSH
• polymerázová řetězová reakce metody   využití   MeSH
• RNA diagnostické užití   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• abstrakty MeSH

Východisko: Expresní microarrays představují vhodnou technologi i pro studium patologických procesů na genomické úrovni. Pro identifikace odlišně exprimovaných genů u pacientů s CML jsme použili plastikové microarrays, které kombinují hlavní přednosti nylonových membrán a skleněných microarrays. Pacienti a Metody. Leukocyty byly izolovány z periferní krve 6 pacientů s chronickou myeloidní leukemií v době stanovení diagnózy. U všech pacientů byl detekován BCR/ABL fúzní gen. Pro detekci expresních profilů byly použity Atlas Human Plastic 8K Microarrays (Clontech) s 8 327 genovými sondami. mRNA byla izolována z 45µg celkové RNA pomocí magnetických částic. Výsledky. Většina genů u pacientů vykazovala stejnou expresi jako kontrolní vzorek. U některých genů bylo možné detekovat podobné změny v expresi u všech (či většiny) pacientů např. zvýšená exprese: lactotransferrin, proteoglycan 2, elastase 2, MMP 9, defensin alpha 1,3,4, peptidoglycan recognition protein, cathepsin G, myeloperoxidase, proteinase 3; snížená exprese: CD68 antigen, cathepsin B, H factor, integrin-alpha X, interleukin 8, preB cell colony enhancing factor. Závěr. Naše studie odhalila variabilitu v expresi mnoha genů, ale i přesto jsme identifikovali skupinu genů s podobnými změnami v aktivitě. Tyto geny by mohly být asociovány s rozvojem onemocnění a budou podrobněji studovány.

Background: Expression microarrays provide a powerful technology for studying disease processes on a genomic scale. We used plastic microarrays for identification of differentially expressed genes in chronic myeloid leukemia patients. Plastic arrays combine the best properties of glass and nylon arrays.Patients and Methods: Leukocytes were isolated from peripheral blood of 6 CML patients at diagnosis. All patients were BCR/ABL fusion gene positive. For gene expression profiling we used Atlas Human Plastic 8K Microarrays (Clontech) with 8 327 gene probes. mRNA was isolated from 45µg of total RNA using magnetic bead method. Results: Majority of the patient genes showed the same transcription activity as in the control sample. In a few genes it was possible to observe similar significant changes of gene expression in all (most) patients e.g.up-regulation: lactotransferrin, proteoglycan 2, elastase 2, MMP9, defensin alpha 1,3,4, peptidoglycan recognition protein, cathepsin G, myeloperoxidase, proteinase 3; down-regulation: CD68 antigen, cathepsin B, H factor, integrin-alpha X, interleukin 8, preB cell colony enhancing factor. Conclusions: Although the study revealed variability of gene expression in many genes, we identified a number of genes with the similar expression regulation. The genes may be associated with the disease process and will be analysed in detail.

• MeSH
• chronická myeloidní leukemie diagnóza   etiologie   genetika   MeSH
• čipová analýza proteinů metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• exprese genu genetika   účinky léků   MeSH
• financování organizované MeSH
• genetický výzkum MeSH
• hematologické nádory diagnóza   etiologie   genetika   MeSH
• interleukiny genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• kathepsiny genetika   imunologie   izolace a purifikace   MeSH
• lékařská onkologie metody   trendy   MeSH
• lidé MeSH
• RNA diagnostické užití   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů metody   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Moderní metodiky studia genové exprese na úrovni RNA využívající DNA čipy (DNA microarrays) představují účinný nástroj nejen pro výzkum onkologických onemocnuní, ale mají i velký potenciál stát se základem nových diagnostických postupů. Jejich úspěšná aplikace však vyžaduje zvládnutí problematických postupů jako jsou odběr vzorku, izolace RNA nebo značení nukleových kyselin. S ohledem na množství různých DNA čipových platforem, neexistuje jeden univerzální návod, který by mohl být pouIit ve všech laboratořích. Protokoly zpracování DNA čipů se proto, někdy velmi výrazně liší, což má negativní dopad i na možnost jejich diagnostického využití.

Gene expression profiling using DNA microarrays represents not only a powerfull tool for oncological research but have also a big potential to become a standard diagnostic technique. However, successfull microarray application needs to overcome some pitfalls such as sample collection, RNA isolation or nucleic acid labeling. Due to the number of microarray platforms there is no universal guide that can be used by all laboratories. The number of sometimes very different protocols for DNA microarray processing has a negative impact on their diagnostic utilization.

• MeSH
• bronchoalveolární laváž využití   MeSH
• diagnostické techniky molekulární metody   trendy   využití   MeSH
• financování organizované MeSH
• kostní dřeň MeSH
• lékařská onkologie metody   trendy   MeSH
• lidé MeSH
• odběr biologického vzorku metody   využití   MeSH
• odběr vzorku krve metody   využití   MeSH
• regulace genové exprese u nádorů genetika   imunologie   MeSH
• RNA diagnostické užití   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů metody   využití   MeSH
• tenkojehlová biopsie metody   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH

V poslední době se v experimentální praxi stále ve větší míře uplatňují metody využívající mikročipové expresní analýzy. Většina expresních analýz v medicínském výzkumu vychází z bioptických vzorků, které obsahují řadu různých typů buněk. Majoritní populace buněk je určující pro celkovou informaci o genové expresi a znemožňuje tak rozlišení specifické genové exprese jednotlivých typů buněk. Mezi metody, které umožňují selekci přesně definovaných populací buněk patří laserová a mechanická mikrodisekce. Současné čipy vyžadují mikrogramová množství značené nukleové kyseliny, přičemž vstupní množství RNA ze selektovaných buněk se může pohybovat pouze v nanogramovém až pikogramovém řádu. Tento problém je možno řešit různými způsoby amplifikace RNA, mezi které patří dvojitá lineární amplifikace RNA nebo metody využívající kombinovanou PCR s linearní amplifikací. V tomto krátkém přehledu poskytujeme jednak informace, se kterými jsme se setkali jednak během naší současné analýzy genové exprese v mikrodisekovaných buňkách mléčné žlázy, a také náš optimalizovaný postup. Celý projekt sestával z časově náročného sběru čerstvě zmražené tkáně, optimalizace přípravy kryofiezů pro mikrodisekci, izolace a amplifikace RNA, hybridizace na mikročipy, analýzy dat a konečně verifikace vybraných výsledků pomocí imunohistochemie. V současné době je vlastní práce v oponentním řízení v zahraničním časopise, a nemůžeme proto poskytnou detailnější informace o získaných výsledcích.

The DNA microarray is a powerful, high throughput technique for assessing gene expression on a systemwide genomic scale. Most expression profiling studies of solid tumors have used biopsy samples containing large numbers of contaminating stromal and other cell types, thereby complicating any precise delineation of gene expression in nontumor versus tumor cell types. Combining microdissection, RNA amplification protocols, microarray technologies and our knowledge of the human genome sequence, it is possible to isolate pure populations of cells or even a single cell and interrogate the expression of thousands of sequences for the purpose of more precisely defining the biology of the tumor cell. In this short overview, we provide informations on selected problems which we had to solve during our microarray analysis of microdissected normal and tumour cells of mammary gland. We provide our optimized procedure as well. The whole project consisted of the long-term collection of snap-frozen tissues, optimalization of staining of cryosections for laser capture microdissection, isolation and amplification of RNA, hybridization onto chips, data analysis and finally verification of the results by immunohistochemistry. Our work is currently reviewed by an international journal and we can’t provide detailed information on particular achievements yet.

• MeSH
• čipová analýza proteinů metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• exprese genu genetika   MeSH
• financování organizované MeSH
• imunohistochemie využití   MeSH
• lasery využití   MeSH
• lidé MeSH
• mikrodisekce metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• mléčné žlázy lidské cytologie   MeSH
• odběr biologického vzorku metody   trendy   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• RNA diagnostické užití   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• techniky amplifikace nukleových kyselin metody   přístrojové vybavení   využití   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• přehledy MeSH