Akutní leukemie (AL) představují heterogenní skupinu maligních onemocnění krvetvorby s různou prognózou. Díky této různorodosti AL nelze s jistotou predikovat odpověď pacienta na léčbu. Proto je velmi důležité sledovat množství zbytkové maligní populace buněk po léčbě, tzv. minimální reziduální nemoc (MRN). K detekci MRN se běžně využívají rekurentní cytogenetické abnormality a mutace v hematologicky významných genech, které jsou rutinním screeningem identifikovány u naprosté většiny dospělých pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií a přibližně u poloviny dospělých pacientů s akutní myeloidní leukemií. Z tohoto důvodu je velmi žádoucí identifikovat nové specifické markery leukemických blastů, které budou sloužit ke sledování MRN u pacientů, u nichž nebyla nalezena žádná ze standardně vyšetřovaných aberací. Naším cílem bylo vyvinout zcela nový technický přístup k identifikaci a mapování unikátních klonálně specifických chromozomových abnormalit až na úroveň jednotlivých nukleotidů, a to pomocí moderních technik molekulární cytogenetiky, zejména mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace, mnohobarevného pruhování chromozomů (mFISH, mBAND) a multiplexní hybridizace fluorescenčně značených sond (BAC-FISH). Pro vyšší rozlišení byly fluorescenčně značené sondy aplikovány na linearizovaná vlákna DNA (molecular combing, fiber-FISH). Dalším nástrojem, který byl využit k přesné identifikaci zlomových míst aberovaných chromozomů byla mikrodisekce derivovaných chromozomů a následné sekvenování disekovaného materiálu pomocí technologie sekvenování nové generace (NGS). Posledním krokem byla konstrukce specifické molekulární PCR eseje v reálném čase pro monitorování MRN, která umožňuje sledovat odpověď pacienta na léčbu, příp. včas zachytit počínající molekulární relaps onemocnění. Moderní technologie umožňují detekovat a identifikovat unikátní klonálně specifické abnormality u pacientů s AL. Předložená práce jasně ukazuje, že mapování chromozomových aberací až na úroveň nukleotidů je pro vybrané pacienty s AL realizovatelné a vhodné pro standardní klinickou praxi. Jedná se o laboratorní přístup „šitý na míru“ nemocných s AL, který naplňuje naši představu o personalizované medicíně.

Acute leukaemia (AL) comprises a heterogeneous group of haematological malignancies with varying prognoses. In light of this heterogeneity, individual patient response to treatment can be difficult to predict. Sensitive monitoring of residual leukemic cell populations (minimal residual disease – MRD) is thus very important and holds great potential for improving treatment strategies. Commonly used MRD targets include recurrent cytogenetic abnormalities and mutations in important haematological genes. Unfortunately, such targets are identified in a majority of adult ALL patients but only in about 50% of adult AML patients. Identification of new specific leukemic blast molecular markers for MRD assessment is therefore highly desirable. Our goal was to develop a unique technical approach for the identification and mapping of clone-specific chromosomal abnormalities down to the single nucleotide level using current molecular cytogenetic techniques, particularly multicolour fluorescence in situ hybridization, multicolour chromosome banding (mFISH, mBAND) and multiplex hybridization of fluorescently labelled BAC clones (BAC-FISH). Higher resolution was achieved by hybridization of fluorescent probes to combed DNA fibres (molecular combing, fibre-FISH). Another approach used for the precise identification of chromosomal breakpoints was chromosome micro dissection followed by next-generation sequencing (NGS) of the dissected material. Finally, a specific Real-Time PCR assay to monitor MRD was designed. Modern technologies open new vistas for the detection and identification of unique clone-specific abnormalities in AL patients. Our work clearly suggests that mapping from the chromosomal level down to the nucleotide level is feasible and readily applicable in eligible AL patients, allowing its´ use in standard clinical practice and as a tool for personalized „tailor-made“ medicine.

Chambon s r o Laboratoř molekulární diagnostiky Praha

FN Hradec Králové 2 interní klinika oddělení klinické hematologie Hradec Králové

FN Královské Vinohrady Interní hematologická klinika Praha

FN Plzeň Hematologicko onkologické oddělení Plzeň

Friedrich Schiller Universität Institut für Human Genetik Jena

Identification of new molecular markers for minimal residual disease assessment in acute leukemia patients