Východisko. U pacientů s chronickou myeloidní leukémií jsme detekovali zvýšenou hladinu exprese genu PCNA, který by se potenciálně mohl podílet na rozvoji onemocnění. Cílem této práce bylo nalézt vhodné podmínky pro transfekci molekul PCNA-siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7 s up-regulovaným PCNA a zvýšenou expresi tlumit. Metody a výsledky. Klíčovými parametry úspěšného vnášení siRNA do buněk jsou typ a množství transfekčního činidla, koncentrace buněk a vnášené siRNA nebo doba inkubace transfekovaných buněk před analýzou exprese. Byla testována tato činidla: ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) a siPORT Amine (Ambion). Účinnost transfekce siRNA značených fluoresceinem byla sledována pomocí fluorescenční mikroskopie. Míra potlačení genové exprese na úrovni mRNA byla stanovována pomocí RT-PCR v reálném čase a na proteinové úrovni metodou western blotů. Jako nejvhodnější byl pro další pokusy vybrán Oligofectamine, pomocí kterého bylo dosaženo 70% poklesu hladiny mRNA genu PCNA. Dále byla zvolena 50 nM koncentrace siRNA, 1x106 buněk/ml a množství Oligofectaminu 4 µl/1ml transfekovaných buněk. Nejvhodnější doba kultivace buněk po transfekci byla 48 hodin. Závěry. Na základě výsledků této práce byl navržen protokol pro vnášení siRNA do buněčných linií K562 a MOLM-7. Tuto techniku lze přenést i na další geny potenciálně přispívající k CML a sledovat dopad siRNA-inhibice genů na expresní profil takto ovlivněných buněk. siRNA proti některým z over-exprimovaných genů by navíc mohly být v budoucnu využity pro genovou terapii CML.

Background. Increased expression of PCNA gene was detected in chronic myeloid leukemia (CML) patients in our laboratory. The gene may participate in the disease development. The aim of the study was to develop appropriate conditions for PCNA-siRNA transfection into K562 and MOLM-7 cell lines (which both have the up-regulated PCNA gene) and to silence the increased expression. Methods and Results. Key parameters of successful siRNA delivery into the cells are type and quantity of transfection reagent, cells and siRNA concentration or cultivation time before an expression analysis. Transfection reagents ExGene 500 (Fermentas), Metafectene (Biontex), Oligofectamine (Qiagen) and siPORT Amine (Ambion) were tested. Transfection efficiency was monitored by fluorescence microscopy of fluorescein labeled siRNA. Gene silencing was determined at mRNA level by real-time PCR and at protein level by western blots. As the most suitable reagent was chosen Oligofectamine, which achieved 70% decrease of PCNA mRNA level. Further, 50 nM siRNA concentration, 1x106 cells/ml and amount of Oligofectamine 4 µl per 1 ml of transfected cells were selected. The best cultivation time after siRNA delivery was 48 h. Conclusions. Based on the results of this study, transfection method for siRNA delivery into the K562 and MOLM-7 cell lines was proposed. The procedure can be transferred also on further selected genes potentially involved in CML and afterwards it will be possible to monitor the impact of siRNA-inhibition on expression profile. In the future siRNAs against some over-expressed genes would be used for gene therapy of CML.

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• malá interferující RNA aplikace a dávkování   imunologie   MeSH
• myeloidní leukemie imunologie   MeSH
• nádorové buněčné linie imunologie   účinky léků   MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra účinky léků   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

Homologous recombination (HR) is essential for maintaining genomic integrity, which is challenged by a wide variety of potentially lethal DNA lesions. Regardless of the damage type, recombination is known to proceed by RAD51-mediated D-loop formation, followed by DNA repair synthesis. Nevertheless, the participating polymerases and extension mechanism are not well characterized. Here, we present a reconstitution of this step using purified human proteins. In addition to Pol δ, TLS polymerases, including Pol η and Pol κ, also can extend D-loops. In vivo characterization reveals that Pol η and Pol κ are involved in redundant pathways for HR. In addition, the presence of PCNA on the D-loop regulates the length of the extension tracks by recruiting various polymerases and might present a regulatory point for the various recombination outcomes.

• MeSH
• DNA-dependentní DNA-polymerasy chemie   fyziologie   MeSH
• DNA-polymerasa III chemie   fyziologie   MeSH
• HeLa buňky MeSH
• homologní rekombinace * MeSH
• jednovláknová DNA biosyntéza   MeSH
• lidé MeSH
• osmolární koncentrace MeSH
• poškození DNA MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra chemie   fyziologie   MeSH
• protein FUS vázající RNA chemie   fyziologie   MeSH
• rekombinasa Rad51 chemie   MeSH
• replikace DNA MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

The aim of our in vitro studies was to understand the role of leptin in controlling proliferation, apoptosis, and protein kinase A (PKA) in human ovarian cells. We analyzed the in vitro effects of leptin (0, 1, 10 or 100 ng/ml) on the accumulation of proliferation-related peptides (PCNA, cyclin B1), apoptosis-associated peptide (Bax) and the intracellular signaling molecule PKA in cultured human granulosa cells using immunocytochemistry and Western immunoblotting. It was observed that leptin stimulated in a dose-dependent manner the accumulation of PCNA (at doses 1-100 ng/ml), cyclin B1 (at doses 10 or 100 ng/ml), Bax (at doses 10 or 100 ng/ml) and PKA (at doses 1-100 ng/ml) in cultured human ovarian cells. These observations suggest the ability of leptin to control directly human ovarian cell functions: proliferation, apoptosis, and intracellular messenger PKA.

• MeSH
• apoptóza MeSH
• buněčný cyklus MeSH
• cyklin B metabolismus   MeSH
• dospělí MeSH
• financování organizované MeSH
• folikulární buňky enzymologie   imunologie   patologie   MeSH
• imunohistochemie MeSH
• kultivované buňky MeSH
• leptin metabolismus   MeSH
• lidé MeSH
• proliferace buněk MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra metabolismus   MeSH
• protein X asociovaný s bcl-2 metabolismus   MeSH
• proteinkinasy závislé na cyklickém AMP metabolismus   MeSH
• rekombinantní proteiny metabolismus   MeSH
• signální transdukce MeSH
• western blotting MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH

• MeSH
• imunohistochemie MeSH
• lidé MeSH
• nádory prsu diagnóza   genetika   MeSH
• onkogenní proteiny analýza   genetika   MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra analýza   genetika   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Successful and accurate completion of the replication of damage-containing DNA requires mainly recombination and RAD18-dependent DNA damage tolerance pathways. RAD18 governs at least two distinct mechanisms: translesion synthesis (TLS) and template switching (TS)-dependent pathways. Whereas TS is mainly error-free, TLS can work in an error-prone manner and, as such, the regulation of these pathways requires tight control to prevent DNA errors and potentially oncogenic transformation and tumorigenesis. In humans, the PCNA-associated recombination inhibitor (PARI) protein has recently been shown to inhibit homologous recombination (HR) events. Here, we describe a biochemical mechanism in which PARI functions as an HR regulator after replication fork stalling and during double-strand break repair. In our reconstituted biochemical system, we show that PARI inhibits DNA repair synthesis during recombination events in a PCNA interaction-dependent way but independently of its UvrD-like helicase domain. In accordance, we demonstrate that PARI inhibits HR in vivo, and its knockdown suppresses the UV sensitivity of RAD18-depleted cells. Our data reveal a novel human regulatory mechanism that limits the extent of HR and represents a new potential target for anticancer therapy.

• MeSH
• aminokyselinové motivy MeSH
• DNA vazebné proteiny chemie   metabolismus   fyziologie   MeSH
• DNA-polymerasa III antagonisté a inhibitory   MeSH
• DNA biosyntéza   MeSH
• HEK293 buňky MeSH
• lidé MeSH
• rekombinační oprava DNA * MeSH
• ubikvitinligasy fyziologie   MeSH
• ultrafialové záření MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

• MeSH
• antigen Ki-67 biosyntéza   MeSH
• cyklin D1 biosyntéza   MeSH
• lidé MeSH
• nádorové biomarkery metabolismus   MeSH
• nádorový supresorový protein p53 biosyntéza   MeSH
• nádory plic diagnóza   metabolismus   mortalita   MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra biosyntéza   MeSH
• protoonkogenní proteiny biosyntéza   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• srovnávací studie MeSH

Myelodysplastic syndrome (MDS) represents a good model for research of prognostic/progression markers due to frequent transformation into acute myeloid leukemia (AML). We analysed expression profiles of 26 MDS and 6 AML patients using cDNA arrays comprising 588 gene probes. The array data were validated in a larger set of 46 patients by qRT-PCR. Data analysis identified differently expressed genes in MDS and the cluster of four genes (ERCC1, FLT1, NME4 and PCNA) whose expression was correlated with MDS subtypes. High expression of these genes was associated with poor prognosis and/or unfavorable outcome. Furthermore, PCNA expression was correlated with peripheral blood blast percentage (r = 0.71, p < 0.05), while the other genes showed non-significant correlation. Our findings demonstrate the progressive up-regulation of the genes along the sequence of 5q-syndrome/RCMD/RAEB/de novo AML, suggesting their association with disease progression.

• MeSH
• DNA vazebné proteiny genetika   MeSH
• dospělí MeSH
• endonukleasy genetika   MeSH
• exprese genu MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• myelodysplastické syndromy diagnóza   MeSH
• nádorové biomarkery analýza   MeSH
• nádorové proteiny MeSH
• NM23-nukleosiddifosfátkinasy genetika   MeSH
• prognóza MeSH
• progrese nemoci MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra genetika   MeSH
• receptor 1 pro vaskulární endoteliální růstový faktor genetika   MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• stanovení celkové genové exprese MeSH
• Check Tag
• dospělí MeSH
• lidé středního věku MeSH
• lidé MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• senioři nad 80 let MeSH
• senioři MeSH
• ženské pohlaví MeSH

Imatinib metylase is the first choice treatment for BCR/ABL positive chronic myelogenous leukemia (CML). However, as some CML patients develop resistance to imatinib therapy, there is a significant interest in development of alternative treatment strategies, such as identifying targets other than BCR/ABL that may participate in CML. Previously, we demonstrated strong PCNA up-regulation in CML patients. To further study its role in CML pathogenesis, we performed silencing of PCNA expression followed by array experiments. PCNA inhibition led to down-regulation of CDK1, CDK4, PLK1, ERK3, JNK1, STAT5, and several inhibitors of apoptosis (DAXX, Mdm2, survivin). The following genes were up-regulated: CDK inhibitors p21 and p19-INK4D, pro-apoptotic FAST kinase, fibronectin, etc. However, as PCNA affects cell growth in naturally proliferating cells as well as in cancerous cells, it seems to act a secondary role relating to proliferation activity of leukemic cells.

• MeSH
• apoptóza MeSH
• bcr-abl fúzní proteiny metabolismus   MeSH
• chemorezistence MeSH
• chronická myeloidní leukemie farmakoterapie   genetika   MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé MeSH
• malá interferující RNA farmakologie   MeSH
• messenger RNA genetika   metabolismus   MeSH
• nádorové biomarkery genetika   MeSH
• nádorové buňky kultivované MeSH
• piperaziny terapeutické užití   MeSH
• polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí MeSH
• proliferace buněk MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra genetika   MeSH
• pyrimidiny terapeutické užití   MeSH
• regulace genové exprese u leukemie MeSH
• RNA nádorová genetika   metabolismus   MeSH
• sekvenční analýza hybridizací s uspořádaným souborem oligonukleotidů MeSH
• stanovení celkové genové exprese MeSH
• umlčování genů MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• apoptóza genetika   MeSH
• chronická hepatitida B imunologie   metabolismus   virologie   MeSH
• játra imunologie   veterinární   virologie   MeSH
• lidé MeSH
• lymfocyty fyziologie   MeSH
• membránové glykoproteiny analýza   fyziologie   MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra analýza   fyziologie   MeSH
• protoonkogenní proteiny analýza   fyziologie   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
• lidé MeSH
• nádory prsu patologie   MeSH
• proliferační antigen buněčného jádra metabolismus   MeSH
• receptor erbB-2 metabolismus   MeSH
• receptory pro estrogeny analýza   MeSH
• receptory progesteronu analýza   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• ženské pohlaví MeSH