Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) has delivered significant insights in understanding the gene expression landscape. Thanks to its precision, sensitivity, flexibility, and cost effectiveness, RT-qPCR has also found utility in advanced single-cell analysis. Single-cell RT-qPCR now represents a well-established method, suitable for an efficient screening prior to single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) experiments, or, oppositely, for validation of hypotheses formulated from high-throughput approaches. Here, we aim to provide a comprehensive summary of the scRT-qPCR method by discussing the limitations of single-cell collection methods, describing the importance of reverse transcription, providing recommendations for the preamplification and primer design, and summarizing essential data processing steps. With the detailed protocol attached in the appendix, this tutorial provides a set of guidelines that allow any researcher to perform scRT-qPCR measurements of the highest standard.

• Klíčová slova
• RT-qPCR, gene expression, preamplification, quantitative PCR, reverse transcription, sample collection, single cell,
• MeSH
• analýza jednotlivých buněk metody   normy   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce metody   normy   MeSH
• lidé MeSH
• reverzní transkripce genetika   MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• stanovení celkové genové exprese metody   normy   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• přehledy MeSH

Successful molecular analyses of human solid tissues require intact biological material with well-preserved nucleic acids, proteins, and other cell structures. Pre-analytical handling, comprising of the collection of material at the operating theatre, is among the first critical steps that influence sample quality. The aim of this study was to compare the experimental outcomes obtained from samples collected and stored by the conventional means of snap freezing and by PAXgene Tissue System (Qiagen). These approaches were evaluated by measuring rRNA and mRNA integrity of the samples (RNA Quality Indicator and Differential Amplification Method) and by gene expression profiling. The collection procedures of the biological material were implemented in two hospitals during colon cancer surgery in order to identify the impact of the collection method on the experimental outcome. Our study shows that the pre-analytical sample handling has a significant effect on the quality of RNA and on the variability of qPCR data. PAXgene collection mode proved to be more easily implemented in the operating room and moreover the quality of RNA obtained from human colon tissues by this method is superior to the one obtained by snap freezing.

• MeSH
• DNA nádorová genetika   MeSH
• DNA-topoisomerasy I genetika   MeSH
• dusík MeSH
• fixace tkání metody   MeSH
• karcinom chemie   chirurgie   MeSH
• kolon chemie   MeSH
• kryoprezervace přístrojové vybavení   metody   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce přístrojové vybavení   metody   MeSH
• lidé MeSH
• nádorové proteiny biosyntéza   genetika   MeSH
• nádory tračníku chemie   chirurgie   MeSH
• ochrana biologická přístrojové vybavení   metody   MeSH
• odběr biologického vzorku přístrojové vybavení   metody   MeSH
• regulace genové exprese u nádorů MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• ribozomální DNA genetika   MeSH
• řízení kvality MeSH
• RNA nádorová analýza   genetika   izolace a purifikace   MeSH
• RNA ribozomální 18S genetika   MeSH
• roztoky pro uchovávání orgánů MeSH
• rychlé screeningové testy přístrojové vybavení   metody   MeSH
• stanovení celkové genové exprese metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• multicentrická studie MeSH
• práce podpořená grantem MeSH
• srovnávací studie MeSH
• Názvy látek
• DNA nádorová MeSH
• DNA-topoisomerasy I MeSH
• dusík MeSH
• nádorové proteiny MeSH
• ribozomální DNA MeSH
• RNA nádorová MeSH
• RNA ribozomální 18S MeSH
• roztoky pro uchovávání orgánů MeSH
• TOP1 protein, human MeSH Prohlížeč