Východiska: Nukleosidové analogy představují významnou skupinu léčiv zvaných antimetabolity, využívaných pro léčbu různých typů nádorových onemocnění. Nicméně, efektivita léčby je často limitována vývojem lékové rezistence. Schopnost nádorových buněk přenášet nukleosidy a nukleosidová analoga dovnitř buňky je považována za jeden z významných faktorů ovlivňujících odpověď na léčbu antimetabolity. Vzhledem k hydrofilním vlastnostem antimetabolitů je jejich transport skrze plazmatickou membránu zprostředkováván dvěma strukturně odlišnými skupinami transmembránových proteinů hENT (SLC29) a hCNT (SLC28) zprostředkovávající rovnovážný, resp. koncentrativní nukleosidový transport. Ztráta funkčnosti nukleosidových transportérů byla asociována se snížením efektivity léčby antimetabolity a jejich deriváty u řady různých nádorových onemocnění vč. adenokarcinomu slinivky. Materiál a metody: Efektivita a kinetika inkorporace antimetabolitů byla analyzována na kontrolních a docetaxel-rezistentních modelech nádoru prostaty. Za tímto účelem bylo využito fluorescenčního nukleosidového analogu uridine-furanu a inhibitoru nukleosidových transportérů S-(4-nitrobenzyl) -6-thioinosinu. Pro analýzu byly využity metodické přístupy zahrnující průtokovou cytometrii, konfokální mikroskopii a kvantitativní real-time polymerázovou řetězovou reakci. Výsledky: V této studii jsme s využitím průtokové cytometrie a fluorescenčního nukleosidového analogu, uridine-furanu, aplikovali metodický přístup pro analýzu aktivity nukleosidových transportérů. Zaměřili jsme se na popis dlouhodobé kinetiky a inkorporace uridine-furanu do buňky u kontrolních a chemorezistentních buněčných modelů PC3. Výsledkem naší práce je průkaz asociace aktivity a mRNA exprese nukleosidových transportérů se senzitivitou daných modelů k různým nukleosidovým analogům. Závěr: Fluorescenční techniky mohou sloužit jako verifikovaný a efektivní nástroj k analýze aktivity nukleosidových transportérů, který má potenciál aplikace v klinické onkologii.

Background: Nucleoside analogues represent a relevant class of antimetabolites used for therapy of various types of cancer. However, their effectivity is limited by drug resistance. The nucleoside transport capability of tumour cells is considered to be a determinant of the clinical outcome of treatment regimens using antimetabolites. Due to hydrophilic properties of antimetabolites, their transport across the plasma membrane is mediated by two families of transmembrane proteins, the SLC28 family of cation-linked concentrative nucleoside transporters (hCNTs) and SLC29 family of energy-independent equilibrative nucleoside transporters (hENTs). Loss of functional nucleoside transporters has been associated with reduced efficacy of antimetabolites and their derivatives and treatment failure in diverse malignancies including solid tumours, such as pancreatic adenocarcinoma. Material and Methods: The effectivity and kinetics of antimetabolite uptake were analysed using control and docetaxel-resistant PC3 cells. For this purpose, fluorescent nucleoside analogue probe uridine-furane and inhibitor of nucleoside transporters, S-(4-nitrobenzyl) -6-thioinosine were exploited. Combination of flow cytometry, confocal microscopy and real-time quantitative polymerase chain reaction methodology were used for the analysis. Results: Here we utilized flow cytometric assay for analysis of nucleoside transporters activity employing fluorescent nucleoside analogue, uridine-furane. We have determined the long-time kinetics of uridine-furane incorporation and quantified its levels in the parental prostate cancer cell line PC3 and its chemoresistant derivative. Finally, we have shown an association between the activity and mRNA expression of nucleoside transporters and sensitivity to various nucleoside analogues. Conclusion: Fluorescent techniques can serve as an effective tool for the detection of nucleoside transporter activity which has the potential for application in clinical oncology.

Department of Chemistry CZ Openscreen Faculty of Science Masaryk University Brno Czech Republic

Department of Comprehensive Cancer Care Masaryk Memorial Cancer Institute Brno Czech Republic

Department of Cytokinetics Institute of Biophysics Academy of Sciences of the Czech Republic v v i Brno Czech Republic

Department of Experimental Biology Faculty of Science Masaryk University Brno Czech Republic

International Clinical Research Center Center for Biomolecular and Cellular Engineering St Anne's University Hospital Brno Czech Republic

Analýza aktivity nukleosidových transportérů u chemorezistentního nádoru prostaty s využitím průtokové cytometrie