Úvod: Mutační analýza genu pro receptor epidermálního růstového faktoru (epidermal growth factor receptor - EGFR) z nádorové tkáně je v současnosti standardním testem u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic. Molekulární testování cirkulující nádorové DNA (circulating tumor DNA - ctDNA) z plazmy se ukazuje být spolehlivou alternativou detekce mutací v případech, kdy není možné získat bioptický či cytologický vzorek z nádoru či je třeba monitorovat léčebnou odpověď pomocí opakovaných vyšetření. Navíc dle recentních prací ctDNA lépe odráží heterogenitu nádorového procesu než odběr z izolované nádorové léze či metastázy. Za účelem zhodnocení analytické kvality testování mutací v genu EGFR z ctDNA izolované z plazmy bylo zorganizováno mezilaboratorní porovnání v rámci referenčních laboratoří prediktivní diagnostiky v České republice. Materiál a metody: Celkem 7 laboratořím bylo zasláno 13 komerčně dostupných referenčních vzorků 2 ml plazmy obsahující nejčastější senzitivní mutace genu EGFR (delece v exonu 19, L858R) a rezistentní mutaci T790M s frekvencí mutací 5; 0,5 a 0,05 %. Jeden vyšetřovaný vzorek obsahoval nemutovanou DNA. Vzorky byly analyzovány metodami standardně využívanými v diagnostické praxi. V 6 ze 7 laboratoří byl použit cobas® EGFR Mutation Test v2, v 1 laboratoři Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit. Výsledky: Určeno bylo 91 genotypů s celkovou chybovostí 24,2 % (22/91). Na 0,5% a vyšší úrovni mutační frekvence činila celková chybovost 3,2 % (2/63), na 5% úrovni 0 % (0/35). Nebyly detekovány žádné falešně pozitivní výsledky. Platforma cobas® dosáhla konzistentně úspěšné detekce na hladině 0,05 % pro deleci v exonu 19. Pro mutace L858R a T790M byl práh detekce nad hodnotou 0,5 %. Závěr: Naše výsledky poukazují na limitovanou citlivost vyšetření mutací EGFR z plazmy, a to zejména mutace T790M. Obzvláště pro vyšetřování ctDNA z plazmy, jejíž frakce může být velice nízká (až 0,01 %), je nutné klást důraz na používání vysoce senzitivních molekulárních metod. Výsledky tohoto porovnání kvality potvrzují nutnost pokusu o rebiopsii u pacientů s negativním výsledkem, neboť oproti vyšetření solidního vzorku tkáně stoupá podíl falešně negativních případů.

Background: Detection of EGFR mutations in tumor tissue represents a standard testing procedure in patients with non-small cell lung cancer. Molecular testing of circulating tumor DNA (ctDNA) in plasma enables detection of mutations in cases where tumor specimens are unavailable or when monitoring of therapeutic responses is necessary. In addition, according to the recent literature, ctDNA better reflects the heterogeneity of the neoplastic cell population than isolated tumor lesion or metastasis. We report a national interlaboratory evaluation aimed at assessing the analytical quality of ctDNA EGFR testing in plasma across seven reference laboratories in the Czech Republic. Material and methods: Aliquots of 13 plasma samples were sent to 7 laboratories and consisted of commercially available 2 ml plasma specimens of genomic DNA with mutant allelic frequencies of 5, 0.5, 0.05, and 0% of the most common sensitizing mutations (deletion in exon 19, L858R) and the resistance mutation T790M. DNA extraction and EGFR testing were performed according to standard procedures. In 6/7 laboratories the cobas® EGFR Mutation Test v2 was used. One laboratory employed the Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit. Results: In total, 91 genotypes were determined with an overall error rate of 24.2% (22/91). The overall error rates were 3.2% (2/63) for the 0.5% mutation frequency and 0% for the 5% mutation frequency (0/35), respectively. No false positive results were reported. The cobas® method achieved consistent results with the 0.05% mutation frequency for the exon 19 deletion. For L858R and T790M mutations, the threshold was above the 0.5% frequency. Conclusions: The results show that EGFR testing for ctDNA in plasma has limited sensitivity, especially for detection of the T790M mutation. Particularly, in ctDNA testing of very low mutated DNA plasma fractions (below 0.01%), emphasis should be placed on the use of highly sensitive molecular methods. The outcomes of this quality assessment confirm the need for rebiopsy in patients with negative plasma results because of a higher false negative rate in comparison to tissue testing.

Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN Hradec Králové

Oddělení onkologické patologie Masarykův onkologický ústav Brno

Oddělení patologie a molekulární medicíny Thomayerova nemocnice Praha

Ústav molekulární a translační medicíny LF UP v Olomouci

Ústav patologie 1 LF UK a VFN Praha

Ústav patologie a molekulární medicíny 2 LF UK a FN Motol Praha

Detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA (ctDNA) retrieved from plasma – Interlaboratory quality assessment in the Czech Republic