V Ústavu hematologie a krevní transfuze se problematikou vrozených poruch ve fibrinogenu zabýváme již více než 10 let a během této doby se nám podařilo nalézt mutaci v molekule fibrinogenu u více než 30 rodin. Tato práce přináší přehled 8 vybraných strukturálně nebo klinicky zajímavých případů dysfibrinogenemie, které se nám podařilo charakterizovat. Jednotlivé případy se liší především svými klinickými projevy. Studium vrozených poruch ve fibrinogenu přináší důležité informace o strukturálních a funkčních částech molekuly fibrinogenu, které se aktivně podílejí na nejrůznějších fyziologických procesech, především na hemostáze. U zhruba 1/3 pacientů s trombózami nebyla doposud nalezena příčina rozvoje trombotických komplikací, je možné, že některé jsou skryty za doposud neodhalenými mutacemi fibrinogenu. Mutace Bβ Arg237Ser, γ Tyr363Asn a Aα Asn106Asp se manifestovaly tromboticky. U nositelů těchto mutací byly zaznamenány jak hluboké žilní trombózy, tak i plicní embolie. V případě mutací Aα Gly13Glu, Aα Arg16Cys, γ Tyr262Cys a γ Arg275His byla zjištěna manifestace krvácivá, s různou intenzitou. Mutace Aα Arg16His se u 7letého pacienta zatím nemanifestovala klinickými příznaky, není však vyloučeno, protože se jedná o mutaci v místě odštěpování fibrinopeptidu A, že se mutace klinicky projeví v pozdějším věku. Výskyt posttranslačně modifikovaného fibrinogenu byl popsán ve spojitosti s řadou různých onemocnění. Ta bývají především spojena s oxidačním stresem, kdy dochází k nekontrolovatelnému nárůstu oxidantů. Oxidanty mění strukturu i funkci fibrinogenu. Námi zvolené modelové systémy reprezentovaly podmínky oxidačního stresu při různých onemocněních. K popisu strukturních změn jsme využili metodu stanovení karbonylů, SDS-PAGE s následnou imunodetekcí. K detekci vzniku tyrosylových radikálů jsme mimo SDA-PAGE s imunodetekcí použili i stanovení pomocí fluorescence. K určení míry oxidačního charakteru fibrinogenu jsme použili OFR (oxidative fibrinogen reactivity). Dále jsme sledovali vliv oxidativních změn na architekturu fibrinové sítě (skenovací elektronová mikroskopie), dále na interakci fibrinogenu s trombinem (odštěpování fibrinopeptidů, turbidimetrické sledování vzniku fibrinové sítě) a krevními destičkami (statická a dynamická adheze krevních destiček). Působením modifikačních látek za podmínek oxidačního stresu vznikají v molekule fibrinogenu nové karbonylové skupiny a tvoří se tyrosylové radikály. U většiny modifikací dochází jak k ovlivnění tvorby fibrinové sítě, tak i interakce s krevními destičkami. Celkové funkční vyznění vzniklých změn závisí na charakteru a intenzitě oxidačního činidla a, což je velmi důležité, pohybuje se od protitrombogenního až po výrazně trombogenní.

At the Institute of Hematology and Blood Transfusion, we have been studying hereditary dysfibrinogenemia for more than ten years. During this period we have described more than 30 families in the Czech Republic with inherited mutations in fibrinogen. This paper provides an overview of 8 interesting cases of dysfibrinogenemia which we have characterized. Individual cases differ mainly in their clinical manifestations. The study of congenital fibrinogen disorders provides scientists and clinicians important information on structural and functional aspects of the fibrinogen molecule during various physiological processes, especially hemostasis. For roughly one third of the patients with thrombosis the causes of their thrombotic complications have not been found yet. It is therefore possible that at least some of them might be the result of mutations in fibrinogen molecule, especially if these changes do not have to affect basic coagulation tests. Mutations Bβ Arg237Ser, γ Tyr363Asn, and Aα Asn106Asp have thrombotic manifestation. The carriers of these mutations reported both deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Mutations Aα Gly13Glu, Aα Arg16Cys, γ Tyr262Cys, and γ Arg275His have bleeding manifestation with varying intensity. A seven year old carrier of the Aα Arg16His mutation has been asymptomatic; however clinical manifestation of the mutation in the future cannot be excluded because the mutation is situated in the site of fibrinopeptide A release. Posttranslational modified fibrinogen is linked with various diseases. These diseases are associated with oxidative stress which leads to uncontrolled production of oxidants. The oxidants modify structure as well as affect function of fibrinogen. We used several oxidative reagents mimicking various (patho)physiological states. We characterized the structural changes with quantification of carbonyls groups and SDS-PAGE followed by immunodetection. Tyrosyl radicals were also detected by SDS-PAGE with immunodetection and by fluorescent determinations. To determine the extent of oxidative nature of the fibrinogen we used OFR (Oxidative Fibrinogen Reactivity). We also studied the influence of these structural changes on the fibrin network architecture (scanning electron microscopy), the interaction of fibrinogen with thrombin (fibrinopeptides release, turbidimetric monitoring of fibrin network formation) and platelets (static and dynamic adhesion of platelets). New carbonyl groups and tyrosyl radicals were formed in fibrinogen. Most modifications occured both to influence fibrin network as well as its interaction with platelets. The overall effect of the functional changes depended on the nature and intensity of the oxidizing agent and what is very important, ranged from protitrombogennic to significantly thrombogenic.

Ústav hematologie a krevní transfuze Oddělení biochemie Praha

Ústav hematologie a krevní transfuze Praha

Studies of structural and functional changes of fibrinogen

Obsahuje 5 tabulek

Literatura