The Gram-negative bacterium Legionella pneumophila is one of the known opportunistic human pathogens with a gene coding for a zinc-dependent S1-P1 type nuclease. Bacterial zinc-dependent 3'-nucleases/nucleotidases are little characterized and not fully understood, including L. pneumophila nuclease 1 (Lpn1), in contrast to many eukaryotic representatives with in-depth studies available. To help explain the principle properties and role of these enzymes in intracellular prokaryotic pathogens we have designed and optimized a heterologous expression protocol utilizing E. coli together with an efficient purification procedure, and performed detailed characterization of the enzyme. Replacement of Ni2+ ions by Zn2+ ions in affinity purification proved to be a crucial step in the production of pure and stable protein. The production protocol provides protein with high yield, purity, stability, and solubility for structure-function studies. We show that highly thermostable Lpn1 is active mainly towards RNA and ssDNA, with pH optima 7.0 and 6.0, respectively, with low activity towards dsDNA; the enzyme features pronounced substrate inhibition. Bioinformatic and experimental analysis, together with computer modeling and electrostatics calculations point to an unusually high positive charge on the enzyme surface under optimal conditions for catalysis. The results help explain the catalytic properties of Lpn1 and its substrate inhibition.
- MeSH
- adenosinmonofosfát metabolismus MeSH
- bakteriální proteiny chemická syntéza chemie metabolismus MeSH
- jednovláknová DNA metabolismus MeSH
- koncentrace vodíkových iontů MeSH
- konformace proteinů MeSH
- Legionella pneumophila enzymologie MeSH
- molekulární modely MeSH
- nukleotidasy chemická syntéza chemie metabolismus MeSH
- proteiny - lokalizační signály fyziologie MeSH
- rekombinantní proteiny chemie izolace a purifikace metabolismus MeSH
- RNA metabolismus MeSH
- sekvence aminokyselin MeSH
- sekvenční homologie aminokyselin MeSH
- sekvenční seřazení MeSH
- statická elektřina MeSH
- substrátová specifita MeSH
- teplota MeSH
- zinek chemie MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- MeSH
- Alzheimerova nemoc farmakoterapie patologie MeSH
- finanční podpora výzkumu jako téma MeSH
- glykogensynthasa antagonisté a inhibitory fyziologie chemie MeSH
- lithium farmakologie fyziologie terapeutické užití MeSH
- proteiny - lokalizační signály fyziologie genetika MeSH
- sloučeniny lithia farmakologie terapeutické užití MeSH
- Publikační typ
- přehledy MeSH
- srovnávací studie MeSH
- MeSH
- membránové transportní proteiny * biosyntéza fyziologie MeSH
- peptidy genetika chemie metabolismus MeSH
- plastidy genetika chemie metabolismus MeSH
- proteinové prekurzory fyziologie metabolismus MeSH
- proteiny - lokalizační signály fyziologie MeSH
- transport proteinů * fyziologie genetika MeSH
- transportní proteiny mitochondriální membrány biosyntéza fyziologie MeSH
