• MeSH
• biologické přípravky * MeSH
• chymotrypsin * izolace a purifikace   MeSH
• dějiny 20. století MeSH
• dějiny lékárnictví MeSH
• farmaceutická technologie * metody   normy   organizace a řízení   pracovní síly   trendy   výchova   MeSH
• farmacie * metody   normy   organizace a řízení   pracovní síly   trendy   MeSH
• inzulin * izolace a purifikace   MeSH
• klinické laboratorní techniky * metody   normy   využití   MeSH
• lidé MeSH
• mladiství MeSH
• orgány z umělého a biologického materiálu * MeSH
• pankreatin * izolace a purifikace   MeSH
• pepsin A * MeSH
• školy * normy   organizace a řízení   pracovní síly   MeSH
• studenti * dějiny   MeSH
• trypsin * izolace a purifikace   MeSH
• učební obory * metody   organizace a řízení   pracovní síly   trendy   MeSH
• výzkum * MeSH
• Check Tag
• dějiny 20. století MeSH
• lidé MeSH
• mladiství MeSH
• mužské pohlaví MeSH
• Publikační typ
• historické články MeSH

The use of trypsin for protein digestion is hampered by its autolysis and low thermostability. Chemical modifications have been employed to stabilize the enzyme. Modified trypsin (e.g. methylated) usually enables performing digestions at elevated temperatures, but it still produces autolytic peptides. In this work, unmodified bovine trypsin was subjected to a microscale affinity chromatography on Arginine Sepharose (ASE) or Benzamidine Sepharose (BSE), which utilized the principle of active-site ligand binding. Trypsin was retained on the sorbents in ammonium bicarbonate as a binding buffer. After washings to remove unbound impurities, the enzyme was eluted by arginine as a free ligand (from ASE) or by diluted hydrochloric acid (from BSE). MALDI-TOF mass spectrometry confirmed removal of large molecular fragments as well as autolytic and other background peptides. Consequently, the purified trypsin was tested for its performance in procedures of in-gel digestion of protein standards and selected urinary proteins from real samples. It has been shown that the affinity purification of trypsin decreases significantly the number of unmatched peptides in peptide mass fingerprints. The presence of arginine in the digestion buffer was found to reduce intensity of autolytic peptides. As a result, the described purification procedure is applicable in a common proteomic routine.

• MeSH
• chromatografie afinitní MeSH
• elektroforéza v polyakrylamidovém gelu MeSH
• mikrochemie metody   MeSH
• peptidové mapování metody   MeSH
• proteinové hydrolyzáty chemie   MeSH
• proteinurie moč   MeSH
• skot MeSH
• spektrometrie hmotnostní - ionizace laserem za účasti matrice metody   MeSH
• trypsin izolace a purifikace   MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• skot MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

We report an efficient and streamlined way to improve the analysis and identification of peptides and proteins in complex mixtures of soluble proteins, cell lysates, etc. By using the shotgun proteomics methodology combined with bioaffinity purification we can remove or minimize the interference contamination of a complex tryptic digest and so avoid the time-consuming separation steps before the final MS analysis. We have proved that by means of enzymatic fragmentation (endoproteinases with Arg-C or/and Lys-C specificity) connected with the isolation of specific peptides we can obtain a simplified peptide mixture for easier identification of the entire protein. A new bioaffinity sorbent was developed for this purpose. Anhydrotrypsin (AHT), an inactive form of trypsin with an affinity for peptides with arginine (Arg) or lysine (Lys) at the C-terminus, was immobilized onto micro/nanoparticles with superparamagnetic properties (silica magnetite particles (SiMAG)-Carboxyl, Chemicell, Germany). This AHT carrier with a determined binding capacity (26.8 nmol/mg of carrier) was tested with a model peptide, human neurotensin, and the resulting MS spectra confirmed the validity of this approach.

• MeSH
• bioreaktory MeSH
• časové faktory MeSH
• chromatografie afinitní metody   přístrojové vybavení   MeSH
• enzymy imobilizované chemie   MeSH
• financování organizované MeSH
• lidé MeSH
• ligandy MeSH
• magnetismus MeSH
• metaloendopeptidasy chemie   MeSH
• nanočástice chemie   MeSH
• neurotensin analýza   MeSH
• oxid křemičitý MeSH
• peptidy analýza   chemie   MeSH
• proteomika MeSH
• reprodukovatelnost výsledků MeSH
• senzitivita a specificita MeSH
• serinové endopeptidasy chemie   MeSH
• spektrometrie hmotnostní - ionizace laserem za účasti matrice metody   MeSH
• trypsin chemie   izolace a purifikace   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH

• MeSH
• anilidy diagnostické užití   MeSH
• arginin analogy a deriváty   diagnostické užití   MeSH
• benzoylarginin nitroanilid * diagnostické užití   MeSH
• cholecystokinin diagnostické užití   MeSH
• chromogenní sloučeniny * diagnostické užití   MeSH
• duodenum enzymologie   MeSH
• klinické enzymatické testy metody   využití   MeSH
• lidé MeSH
• sekretin diagnostické užití   MeSH
• statistika jako téma MeSH
• studie případů a kontrol MeSH
• tosylargininmethylester * diagnostické užití   MeSH
• trypsin izolace a purifikace   metabolismus   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH