Reptin is a member of the AAA+ superfamily whose members can exist in equilibrium between monomeric apo forms and ligand bound hexamers. Inter-subunit protein-protein interfaces that stabilize Reptin in its oligomeric state are not well-defined. A self-peptide binding assay identified a protein-peptide interface mapping to an inter-subunit "rim" of the hexamer bridged by Tyrosine-340. A Y340A mutation reduced ADP-dependent oligomer formation using a gel filtration assay, suggesting that Y340 forms a dominant oligomer stabilizing side chain. The monomeric ReptinY340A mutant protein exhibited increased activity to its partner protein AGR2 in an ELISA assay, further suggesting that hexamer formation can preclude certain protein interactions. Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) demonstrated that the Y340A mutation attenuated deuterium suppression of Reptin in this motif in the presence of ligand. By contrast, the tyrosine motif of Reptin interacts with a shallower pocket in the hetero-oligomeric structure containing Pontin and HDX-MS revealed no obvious role of the Y340 side chain in stabilizing the Reptin-Pontin oligomer. Molecular dynamic simulations (MDS) rationalized how the Y340A mutation impacts upon a normally stabilizing inter-subunit amino acid contact. MDS also revealed how the D299N mutation can, by contrast, remove oligomer de-stabilizing contacts. These data suggest that the Reptin interactome can be regulated by a ligand dependent equilibrium between monomeric and hexameric forms through a hydrophobic inter-subunit protein-protein interaction motif bridged by Tyrosine-340. SIGNIFICANCE: Discovering dynamic protein-protein interactions is a fundamental aim of research in the life sciences. An emerging view of protein-protein interactions in higher eukaryotes is that they are driven by small linear polypeptide sequences; the linear motif. We report on the use of linear-peptide motif screens to discover a relatively high affinity peptide-protein interaction for the AAA+ and pro-oncogenic protein Reptin. This peptide interaction site was shown to form a 'hot-spot' protein-protein interaction site, and validated to be important for ligand-induced oligomerization of the Reptin protein. These biochemical data provide a foundation to understand how single point mutations in Reptin can impact on its oligomerization and protein-protein interaction landscape.
- MeSH
- AAA doména * MeSH
- ATPázy spojené s různými buněčnými aktivitami chemie metabolismus MeSH
- DNA-helikasy chemie metabolismus MeSH
- interakční proteinové domény a motivy fyziologie MeSH
- lidé MeSH
- molekulární chaperony chemie metabolismus MeSH
- multimerizace proteinu * MeSH
- mutace MeSH
- simulace molekulární dynamiky MeSH
- transportní proteiny chemie metabolismus MeSH
- tyrosin genetika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Východiska: Vývoj biofarmaceutik je nejrychleji se rozvíjející oblastí dnešního farmaceutického průmyslu. Analýza proteinových terapeutik je však velice náročný úkol kvůli jejich velikosti a komplexnosti prostorové struktury. Jakékoliv změny v primární, sekundární, terciální či kvarterní struktuře proteinů mohou mít výrazný vliv na jejich funkci, účinnost a v neposlední řadě i toxicitu. Hmotnostní spektrometrie se v minulosti osvědčila jako kvalitní nástroj pro analýzu primární struktury proteinů (aminokyselinové sekvence) a v posledních letech je díky rozvoji nových metod schopná analyzovat i vyšší proteinové struktury. Jednou z těchto nových metod je vodík/deuteriová výměna (HDX). HDX je založena na výměně amidových vodíků aminokyselinového řetězce za deuteria z okolního roztoku. Vodíky nacházející se na povrchu proteinu jsou za deuteria vyměňovány mnohem rychleji než vodíky schované uvnitř proteinu. Získané výsledky z HDX metody mohou poskytnout informace o prostorové struktuře proteinu a také o protein-proteinových a protein-ligandových interakcí. Navíc analýzou výměny deuterií v různých časových intervalech může tato metoda poskytnout informace i o dynamických změnách proteinové struktury a dynamice proteinových interakcí. Vzhledem k možnostem, které tato metoda nabízí, se HDX stala atraktivní metodou pro charakterizaci proteinových biofarmaceutik. Cíl: Cílem tohoto přehledového článku je poukázat na možnosti využití hmotnostní spektrometrie v biofarmaceutickém průmyslu se zaměřením na metodu HDX a její aplikace.
Background: The development of biopharmaceutics is the fastest growing segment of the present pharmaceutical industry. The analysis of proteins therapeutics is a challenging task due to their large size and complexity of spatial structure. Any changes in the primary, secondary, tertiary or quaternary protein structure can have huge impact on their function, efficiency and toxicity. Mass spectrometry proved itself to be a powerful tool for analysis of primary protein structure (amino acid sequence) and thanks to the development of new techniques in last years it is able to analyse higher order protein structures. One of these new techniques is hydrogen/deuterium exchange (HDX). HDX is based on exchange of amid protons with deuterium from solution on the protein backbone chain. Protons on the surface of protein are exchanging with deuterium much faster than protons buried inside of protein. HDX results could provide information about spatial protein structure and also about protein-protein interactions and protein-ligand interactions. Furthermore, by analysing of deuterium exchange in different time points this method could give information about dynamic changes of protein structure and dynamics of proteins interactions. Because of possibilities of this method, HDX become attractive method for characterization of protein biopharmaceuticals. Aims: This review article is focused on the utilization of mass spectrometry in biopharmaceutical industry and mainly on HDX method and its applications.
- Klíčová slova
- vodík/deuteriová výměna,
- MeSH
- farmaceutický průmysl MeSH
- hmotnostní spektrometrie metody využití MeSH
- konformace proteinů MeSH
- krystalografie rentgenová využití MeSH
- lidé MeSH
- mapování epitopu metody využití MeSH
- objevování léků metody MeSH
- proteiny analýza terapeutické užití MeSH
- proteomika metody MeSH
- translační modifikace proteinu MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Mnoho buněčných proteinů tvoří oligomery. Rovnováha mezi monomerním a oligomerním stavem těchto proteinů hraje důležitou roli v regulaci proteinové aktivity. Ovlivnění oligomerizace se tudíž nabízí jako zajímavý přístup při vývoji nových terapeutických látek. Cílem tohoto přehledového článku je shrnout informace o procesu proteinové oligomerizace a možnostech její cílené modulace. Role oligomerizace v onkogenezi je prezentována na příkladu nádorového supresorového proteinu p53, u kterého jsou v současné době zkoumány látky stabilizující jeho tetramerní strukturu. Z metod pro studium oligomerizace je zde představena metoda vodík/deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií, která je vhodná pro detekci protein‑proteinových interakcí a analýzu dynamiky oligomerizace.
Many cellular proteins form oligomers. The equilibrium between monomeric and oligomeric states of these proteins is important for the regulation of protein activity. Modulation of the oligomerization equilibrium could be an interesting approach in the development of new therapeutic agents. This review summarizes information about protein oligomerization and modulation of this process, demonstrating the role of oligomerization in oncogenesis by tumor suppressor protein p53, which forms tetrameric structure. Today, many studies focus on finding compounds that stabilize its tetramers. Among the methods for studying oligomerization, we present hydrogen/deuterium exchange method coupled with mass spectrometry which is suitable for the detection of protein‑protein interaction and analysis of oligomerization dynamics. Key words: proteomics – drug design – tumor suppressor protein p53 – oligomerization – hydrogen/deuterium exchange This study was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), MEYS – NPS I – LO1413, MH CZ – DRO (MMCI, 00209805) and BBMRI_CZ (LM2010004). The authors declare they have no potential confl icts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 9. 4. 2015 Accepted: 15. 6. 2015
- Klíčová slova
- vodík/deuteriová výměna,
- MeSH
- deuterium MeSH
- konformace proteinů MeSH
- lidé MeSH
- nádorový supresorový protein p53 * MeSH
- objevování léků MeSH
- proteiny chemie MeSH
- proteomika * MeSH
- sbalování proteinů MeSH
- vodík-deuteriová výměna * MeSH
- vodík MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
Hydrogen/deuterium exchange connected with mass spectrometry is increasingly applied for the interrogation of protein conformation, mapping protein dynamics, identification of protein-ligand interaction sites, and allosteric conformation changes. The dynamics of protein changes is determined with the m/z value of deuterated and non-deuterated protein or percentage of deuterium incorporation for the digested peptides. Hydrogen/deuterium exchange data are processed with selected software and finally quaternary structure of protein is visualized showing how different protein and ligand chains hook up with each other. Obtained results can help understand how protein interacts with its ligand and elucidate the role of this complex in a living organism. Utilization of this method is demonstrated by the amyloid-beta peptide aggregation associated with Alzheimer´s disease; determination of the structure toxin-co-regulated pili Vibrio cholerae in connection with its pathogenesis or revelation of binding sites on Mouse double minute 2 homolog complex with small molecule Nutlin-3 which is important for elucidation of drug effects in cancer research.
- MeSH
- alosterické místo účinky léků MeSH
- Alzheimerova nemoc etiologie MeSH
- hmotnostní spektrometrie * metody využití MeSH
- konformace proteinů MeSH
- lidé MeSH
- ligandy MeSH
- mapování interakce mezi proteiny * využití MeSH
- nádory MeSH
- peptidové mapování metody využití MeSH
- simulace molekulární dynamiky využití MeSH
- vazba proteinů * MeSH
- výzkum MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
- přehledy MeSH
