The opportunistic fungal pathogen Cryptococcus neoformans is a major cause of mortality in immunocompromised individuals, resulting in more than 600,000 deaths per year. Many human fungal pathogens secrete peptidases that influence virulence, but in most cases the substrate specificity and regulation of these enzymes remains poorly understood. The paucity of such information is a roadblock to our understanding of the biological functions of peptidases and whether or not these enzymes are viable therapeutic targets. We report here an unbiased analysis of secreted peptidase activity and specificity in C. neoformans using a mass spectrometry-based substrate profiling strategy and subsequent functional investigations. Our initial studies revealed that global peptidase activity and specificity are dramatically altered by environmental conditions. To uncover the substrate preferences of individual enzymes and interrogate their biological functions, we constructed and profiled a ten-member gene deletion collection of candidate secreted peptidases. Through this deletion approach, we characterized the substrate specificity of three peptidases within the context of the C. neoformans secretome, including an enzyme known to be important for fungal entry into the brain. We selected a previously uncharacterized peptidase, which we term Major aspartyl peptidase 1 (May1), for detailed study due to its substantial contribution to extracellular proteolytic activity. Based on the preference of May1 for proteolysis between hydrophobic amino acids, we screened a focused library of aspartyl peptidase inhibitors and identified four high-affinity antagonists. Finally, we tested may1Δ strains in a mouse model of C. neoformans infection and found that strains lacking this enzyme are significantly attenuated for virulence. Our study reveals the secreted peptidase activity and specificity of an important human fungal pathogen, identifies responsible enzymes through genetic tests of their function, and demonstrates how this information can guide the development of high affinity small molecule inhibitors.

• MeSH
• aspartátové proteasy metabolismus   MeSH
• Cryptococcus neoformans enzymologie   patogenita   MeSH
• faktory virulence metabolismus   MeSH
• fungální proteiny metabolismus   MeSH
• hmotnostní spektrometrie MeSH
• imunoblotting MeSH
• koncentrace vodíkových iontů MeSH
• kryptokokóza enzymologie   MeSH
• kvantitativní polymerázová řetězová reakce MeSH
• modely nemocí na zvířatech MeSH
• myši MeSH
• proteasy metabolismus   MeSH
• proteomika MeSH
• stanovení celkové genové exprese MeSH
• virulence MeSH
• zvířata MeSH
• Check Tag
• myši MeSH
• zvířata MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH

• Publikační typ
• abstrakty MeSH

Streptococcus pneumoniae carries a single Ser/Thr protein kinase gene stkP in its genome. Biochemical studies performed with recombinant StkP have revealed that this protein is a functional membrane-linked eukaryotic-type Ser/Thr protein kinase. Here, we demonstrate that the deletion of its extracellular domain negatively affects the stability of a core kinase domain. In contrast, the membrane anchored kinase domain and the full-length form of StkP were stable and capable of autophosphorylation. Furthermore, evidence is presented that StkP forms dimers through its transmembrane and extracellular domains.

• MeSH
• bakteriální proteiny metabolismus   MeSH
• dimerizace MeSH
• elektroforéza v polyakrylamidovém gelu MeSH
• epitopy metabolismus   MeSH
• financování organizované MeSH
• fosforylace MeSH
• protein-serin-threoninkinasy metabolismus   MeSH
• signální transdukce MeSH
• Streptococcus pneumoniae enzymologie   MeSH

Human cathepsin D (CatD), a pepsin-family aspartic protease, plays an important role in tumor progression and metastasis. Here, we report the development of biomimetic inhibitors of CatD as novel tools for regulation of this therapeutic target. We designed a macrocyclic scaffold to mimic the spatial conformation of the minimal pseudo-dipeptide binding motif of pepstatin A, a microbial oligopeptide inhibitor, in the CatD active site. A library of more than 30 macrocyclic peptidomimetic inhibitors was employed for scaffold optimization, mapping of subsite interactions, and profiling of inhibitor selectivity. Furthermore, we solved high-resolution crystal structures of three macrocyclic inhibitors with low nanomolar or subnanomolar potency in complex with CatD and determined their binding mode using quantum chemical calculations. The study provides a new structural template and functional profile that can be exploited for design of potential chemotherapeutics that specifically inhibit CatD and related aspartic proteases.

• MeSH
• biomimetické materiály chemická syntéza   chemie   metabolismus   toxicita   MeSH
• Caco-2 buňky MeSH
• cyklické peptidy chemická syntéza   chemie   metabolismus   toxicita   MeSH
• enzymatické testy MeSH
• inhibitory proteas chemická syntéza   chemie   metabolismus   toxicita   MeSH
• kathepsin D antagonisté a inhibitory   chemie   metabolismus   MeSH
• kinetika MeSH
• lidé MeSH
• molekulární struktura MeSH
• pepstatiny chemie   MeSH
• vazba proteinů MeSH
• vazebná místa MeSH
• vztahy mezi strukturou a aktivitou MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH
• Publikační typ
• časopisecké články MeSH
• práce podpořená grantem MeSH

Úvod: Cílem studie bylo porovnat markery buněčného poškození a aktivace trombocytů směsných trombocytových transfuzních přípravků vyrobených z buffy-coatu během skladování ve dvou aditivních roztocích a připravených do dvou různých souprav. Aditivní roztoky snižují riziko potransfuzních reakcí způsobených plazmou a zachovávají plazmu pro klinické použití nebo frakcionaci. Materiál a metoda: Trombocytové transfuzní přípravky byly vyrobeny smísením čtyř buffy-coatů a resuspendovány v jednom ze dvou aditivních roztoků (Composol, Fresenius – Kabi; T-Sol, Baxter Corp.) v poměru 70 % aditivní roztok a 30 % plazma. Pro smísení byly použity dvě různé soupravy (R4R7036, Fenwal; Autostop, Pall Corp.). V den skladování 0 a 5 byly odebírány vzorky pro laboratorní vyšetření a testován počet trombocytů v přípravcích, hodnota pH, obsah glukózy, laktátu a sP-selektinu. K hodnocení jsme použili dvouvýběrový t-test, párový test, Pearsonův korelační koeficient. Statistická významnost byla posouzena na hladině p < 0,05. Výsledky: Počet trombocytů byl vyšší než 2 x 1011/T.U. ve všech přípravcích. Během pětidenního skladování byl prokázán statisticky významný pokles obsahu trombocytů u všech typů směsí. Na konci skladování byla hodnota pH byla vyšší než 6,8 u všech typů přípravků. Konsumpce glukózy a produkce laktátu byla statisticky významná u všech porovnávaných přípravků, přičemž produkce laktátu a konsumpce glukózy byla vyšší u trombocytových transfuzních přípravků v roztoku T-Sol než v roztoku Composol a odpovídala poklesu pH. Byl prokázán i vliv použité soupravy na aktivaci trombocytů. Závěr: Vývoj markerů buněčného poškození trombocytů v transfuzních přípravcích byl ovlivněn zejména použitým skladovacím roztokem, použité soupravy ovlivňovaly stav aktivace trombocytu.

Background: The aim of the study was to compare markers of cell damage and platelet activation of buffy-coat derived platelet concentrates (PCs) during storage in two types of additive solutions (PASs) in two different storage bags. PASs reduce plasma-associated transfusion reactions and conserve plasma for transfusion or fractionation. Materials and Methods: PCs were prepared from leukocyte-depleted pools of four buffy-coats (BCPs) suspended in one of 70% PASs: 30% plasma (Composol, Fresenius - Kabi; T-Sol, Baxter Corp.). Two different storage bags were used (R4R7036, Fenwal; Autostop, Pall Corp.). On the days 0 and 5 of storage samples were tested for PLT concentration, pH, glucose, lactate and sP-Selectin. Data were analyzed by analysis with two-sample t-tests, paired test and Pearson correlation coefficient. Statistical significance was assessed at p <0.05. Results: PLT yields were higher then 2x1011platelets/unit in all of PCs. There was the significant decrease of platelet concentration during storage for 5 days in all bags or media. The pH of all PCs was 6.8 on the 5th day of storage. Glucose consumption and lactate production in all types of bags and media were significantly different during storage. Lactate production and glucose consumption in T-Sol were higher than those items in Composol and they resulted in lower pH values. We showed the influence of storage bags for platelet activation, too. Conclusion: The development of markers of cell damage in PCs was influenced mainly by used platelet storage solution, platelet storage bags affected the status of platelet activation.

• Klíčová slova
• skladování trombocytů, funkce trombocytu,
• MeSH
• aktivace trombocytů MeSH
• klinické laboratorní techniky MeSH
• lidé MeSH
• roztoky chemie   MeSH
• transfuze trombocytů MeSH
• trombocytopatie diagnóza   krev   MeSH
• uchovávání tkání metody   MeSH
• Check Tag
• lidé MeSH