This work explores the interaction of 9/10-nitro-oleic acid (NO2-OA) with human serum albumin (HSA). The molecular mechanism of the biological action of NO2-OA is to our knowledge based on a reversible covalent reaction-Michael addition of nucleophilic amino acid residues of proteins. Since HSA is an important fatty acid transporter, a key question is whether NO2-OA can bind covalently or non-covalently to HSA, similarly to oleic acid (OA), which can interact with the FA1-FA7 binding sites of the HSA molecule. 1H NMR studies and competition analysis with OA and the drugs ibuprofen and warfarin were used to investigate a potential non-covalent binding mode. NO2-OA/HSA binding was confirmed to compete with warfarin for FA-7 with significantly higher affinity. NO2-OA competes with ibuprofen for FA-3 and FA-6, however, in contrast to the situation with warfarin, the binding affinities are not significantly different. The described interactions are based exclusively on non-covalent binding. No covalent binding of NO2-OA to HSA was detected by MS/MS. More detailed studies based on MALDI-TOF-MS and Ellman's assay indicated that HSA can be covalently modified in the presence of NO2-OA to a very limited extent. It was also shown that NO2-OA has a higher affinity to HSA than that of OA.
Východiska: Glykosylace je posttranslační modifikace, která je zapojena do mnoha biologických procesů a významně zasahuje i do dějů spojených s nádorovou progresí. Změny glykanových struktur na povrchu nádorových buněk způsobené alterujícími hladinami exprese glykosyltransferáz a glykosidáz ovlivňují proliferaci, adhezi, migraci i buněčnou signalizaci. Přítomnost neobvyklých glykanových struktur a glykokonjugátů v sérech byla popsána u mnohých onkologických onemocnění a řada glykoproteinů byla schválena Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv v USA jako nádorové biomarkery pro klinická vyšetření. V současnosti se pozornost při hledání nových glykomarkerů zaměřuje na detekci proteinů s aberantní glykosylací nebo zvýšenou koncentrací v sérech nebo exozomech, a to z důvodu jejich aktivní sekrece nebo uvolňování z nádorových buněk do extracelulárního prostoru. Cíl: Cílem článku bylo popsat strukturu glykanů, glykoproteinů i glykokonjugátů a přiblížit jejich funkci ve vývoji a progresi nádorů. Dalším cílem bylo čtenáře seznámit s vybranými klinicky schválenými glykoproteiny využívanými k diagnostice onkologických onemocnění (AFP, PSA, CA 125, HE4). Pozornost byla zaměřena na změny v glykanové struktuře uvedených proteinů, jejich funkce, koncentrace v sérech a jejich využití v klinice a diagnostice onkologických onemocnění.
Background: Glycosylation is a posttranslational modification that is involved in many biological processes and significantly affects the processes associated with tumour progression. Changes in glycan structures on the surface of tumour cells caused by altering levels of glycosyltransferase and glycosidase expression affect proliferation, adhesion, migration and cellular signalling. The presence of aberrant glycan structures and glycoconjugates in the sera of oncological patients has been reported in many cancers. Consequently, many glycoproteins have been approved by the U.S. Food and Drug Administration as tumour biomarkers for clinical investigations. At present, attention is focused on the search for new glycomarkers that are decorated by aberrant glycosylation or are overexpressed in the serum or exosomes due to their active secretion or release from tumour cells to the extracellular space. Purpose: The aim of this article has been to review the structure of glycans, glycoproteins and other glycoconjugates and to give more details about their functions in the development and progression of tumours. Another aim was to familiarise the reader with selected clinically approved glycoproteins used to diagnose oncological diseases (AFP, PSA, CA 125, HE4). Attention was paid to changes in the glycan structure of these proteins, their function, serum concentrations and clinical use in the diagnostics of cancer.
Východiska: K léčbě onkologických onemocnění se používají kombinace postupů založených nejčastěji na chirurgickém odstranění nádoru, radioterapii, chemoterapii či hormonální terapii, přičemž samotný chirurgický zákrok většinou představuje stěžejní krok pro odstranění nádorové masy. Je ovšem často provázen problémy s určením ohraničení nádoru. Chirurg má před operací k dispozici pouze informace z předoperačních vyšetření, která naznačují lokalizaci a rozsah nádoru, ale neurčí jasné hranice mezi nádorovou a zdravou tkání. Tuto oblast ve většině případů nelze rozeznat zrakem či hmatem, a pokud není nádor zcela odstraněn, musí pacient podstoupit reoperaci. Cíl: Nové technologie vyvíjené ve výzkumných centrech umožňují operatérovi získat informace o stavu nádorové tkáně v reálném čase přímo na operačním sále v průběhu chirurgického zákroku. Patří mezi ně přístroje MarginProbe, Spectropen a spektroskopický tkáňový skener. Další skupinu tvoří zobrazovací techniky využívající hmotnostní spektrometrii k určování tkáňové specifičnosti. V posledních letech prošla obrovským vývojem technika intraoperativní hmotnostní spektrometrie (REIMS). Využívá elektronický skalpel, kterým chirurg provádí řez tkáně, přičemž vznikající aerosol je odváděn do hmotnostního spektrometru, jenž během několika desetin sekund získá hmotnostní spektra fosfolipidů specifických pro operovanou tkáň (nádorovou či zdravou). V České republice se již tato technologie využívá ve výzkumu k detekci koncentrace léčiva deponovaného v nádorové a zdravé tkáni myší trpících melanomem. Získané výsledky ukazují, že pomocí tohoto přístroje by bylo možné zásadním způsobem ovlivnit léčbu i její účinnost u onkologických onemocnění. O těchto nových technologiích vás v článku budeme podrobněji informovat a seznamovat s jejich principy a využitím.
Background: The treatment of oncological diseases is based on the combination of surgery, representing the key step for the removal of the tumor tissue, radiotherapy, chemotherapy, and hormone therapy. However, the surgery is often accompanied by issue of determining the boundaries of the tumor. Prior the operation, the surgeon has information on preoperative ndings, which indicate the location a
- Klíčová slova
- MarginProbe, SpectroPen, Ramanův skener, REIMS,
- MeSH
- hmotnostní spektrometrie dějiny využití MeSH
- lidé MeSH
- mikroskopie metody využití MeSH
- molekulární patologie metody MeSH
- nádory podle lokalizace MeSH
- nádory * chirurgie MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
As a part of the innate immunity, NK (Natural Killer) cells provide an early immune response to different stimuli, e.g. viral infections and tumor growths. However, their functions are more complex; they play an important role in reproduction, alloimmunity, autoimmunity and allergic diseases. NK cell activities require an intricate system of regulation that is ensured by many different receptors on a cell surface which integrate signals from interacting cells and soluble factors. One way to understand NK cell biology is through the structure of NK receptors, which can reveal ligand binding conditions. We present a modified protocol for recombinant expression in Escherichia coli and in vitro refolding of the ligand-binding domain of the inhibitory Nkrp1b (SJL/J) protein. Nkrp1b identity and folding was confirmed using mass spectrometry (accurate mass of the intact protein and evaluation of disulfide bonds) and one-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. The intention is to provide the basis for conducting structural studies of the inhibitory Nkrp1b protein, since only the activating Nkrp1a receptor structure is known.
- MeSH
- buněčná inkluze MeSH
- disulfidy chemie MeSH
- Escherichia coli metabolismus MeSH
- hmotnostní spektrometrie MeSH
- lektinové receptory NK-buněk - podrodina B biosyntéza chemie genetika MeSH
- magnetická rezonanční spektroskopie MeSH
- molekulární sekvence - údaje MeSH
- myši MeSH
- refolding proteinů MeSH
- rekombinantní proteiny biosyntéza MeSH
- sekvence aminokyselin MeSH
- zvířata MeSH
- Check Tag
- myši MeSH
- zvířata MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Nádory jsou geneticky a klinicky velmi různorodá onemocnění, a proto se v poslední době řada proteomických studií zabývá hledáním biomarkerů, které by usnadnily prognostiku, diagnostiku či léčbu onkologických onemocnění. Účinným nástrojem je hmotnostní spektrometrie umožňující identifikaci, kvantifikaci a charakterizaci biomolekul v komplexních biologických vzorcích. Prvním krokem vedoucím k selekci biomarkerů je tzv. discovery proteomika, jejímž cílem je detailní analýza vzorků směřující ke zmapování a porovnání přítomných proteinů a výběru vhodných kandidátů na potenciální biomarkery. V dalším kroku proteomické analýzy probíhá verifikace vybraných biomarkerů tzv. cílenou (targeted) proteomikou, jejímž úkolem je ověření přítomnosti a kvantity daného proteinu v analyzovaných, přesně klinicky definovaných vzorcích. Předložený článek je zaměřen na popis různých typů metod vhodných pro kvantitativní analýzu proteinů využívající hmotnostní spektrometrií.
Cancers are genetically and clinically very heterogeneous diseases; therefore, various proteomic studies have been trying to find biomarkers which can facilitate prognosis, diagnosis or treatment of these oncological diseases. The mass spectrometry is an effective tool for identification, quantitation, and characterization of biomolecules in the complex biological samples. The first step suitable for selection of biomarkers called discovery proteomics provides a detailed analysis of the samples contributing to the identification of proteins, comparison of their presence in the samples, and selection of the convenient candidates for the prospective biomarkers. The next step of proteomics analysis is directed towards verification of chosen biomarkers with the approach called targeted proteomics. This technique evaluates presence and quantity of the proteins (biomarkers) in clinically precisely defined samples. This article focuses on the description of various approaches suitable for the quantitative analysis of the proteins connected with mass spectrometry. Key words: quantitative proteomics – mass spectrometry – protein – biomarker – oncology – cancer This work was supported by the European Regional Development Fund and the State Budget of the Czech Republic (RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) and by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805). The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study. The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers. Submitted: 20. 1. 2014 Accepted: 7. 4. 2014
- Klíčová slova
- kvantitativní proteomika, SILAC,
- MeSH
- hmotnostní spektrometrie * metody MeSH
- izotopové značení MeSH
- lidé MeSH
- nádorové biomarkery * analýza metabolismus MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- nádorové buňky kultivované * MeSH
- nádorové proteiny * analýza metabolismus MeSH
- nádory diagnóza MeSH
- proteomika MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
MDM2 is a multidomain protein that functions as an E3 ubiquitin ligase, transcription repressor, mRNA-binding protein, translation factor, and molecular chaperone. The small molecule Nutlin-3 has been engineered to bind to the N-terminal hydrophobic pocket domain of MDM2. This binding of Nutlin-3 has two consequences: (i) antagonistic effects through competitive disruption of the MDM2-p53 complex and (ii) agonist effects that allosterically stabilize MDM2 protein-protein interactions that increase p53 ubiquitination as well as nucleophosmin deoligomerization. We present a methodology using a hydrogen/deuterium (H/D) exchange platform that measures Nutlin-3 binding to the N-terminal domain of MDM2 (MDM2(1-126)) in order to begin to develop dynamic assays that evaluate MDM2 allostery. In order to localize the regions in MDM2 being suppressed by Nutlin-3, MDM2 was incubated with the ligand and H/D amide exchange was measured after pepsin digestion. One dynamic segment containing amino acids 55-60 exhibited slower deuterium exchange after Nutlin-3 binding, reflecting ligand binding within the hydrophobic pocket. However, another dominant suppression of H/D exchange was observed in a motif from amino acids 103-107 that reflects surface hydrophobic residues surrounding the hydrophobic pocket of MDM2. In order to explore the consequences of this latter Nutlin-3 interaction site on MDM2, the Y104G and L107G mutant series was constructed. The MDM2(Y104G) and MDM2(L107G) mutants were fully active in p53 binding. However, the authentic p53-derived peptide:MDM2(Y104G) complex exhibited partial resistance to Nutlin-3 inhibition, while the p53-mimetic 12.1 peptide:MDM2(Y104G) complex retained normal Nutlin-3 responsiveness. These data reveal the existence of a second functional Nutlin-3-binding site in a surface hydrophobic patch of MDM2, flanking the hydrophobic pocket. This reveals two modes of peptide binding by MDM2 and highlights the utility of H/D exchange as an assay for measuring allosteric effects in MDM2.
- MeSH
- alosterické místo MeSH
- imidazoly chemie metabolismus MeSH
- lidé MeSH
- molekulární modely MeSH
- molekulární sekvence - údaje MeSH
- peptidové fragmenty MeSH
- piperaziny chemie metabolismus MeSH
- protoonkogenní proteiny c-mdm2 chemie metabolismus MeSH
- sekvence aminokyselin MeSH
- vodík-deuteriová výměna metody MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- časopisecké články MeSH
- práce podpořená grantem MeSH
Exprese p63 je nezbytná pro tvorbu epidermis a dalších vrstev epitelu. Je přítomen ve vysokých koncentracích v různých kožních nádorech, podílí se na rakovinném bujení a kontroluje chemosenzitivitu. Identifikace interakčních partnerů p63 je nezbytná pro pochopení celého systému genové regulace řídící vývoj epitelu. Tyto znalosti mohou také pomoci objasnit signální dráhy podílející se na odpovědi lidské kůže poškozené UV zářením. K identifikaci proteinů tvořících komplexy s ∆Np63 byly použity proteomické přístupy. Proteiny byly izolovány imunoprecipitací ∆Np63-specifickou protilátkou a následně analyzovány hmotnostní spektrometrií. Identifikovali jsme 23 proteinů, potenciálních interakčních partnerů ∆Np63, které nebyly nalezeny v kontrolních vzorcích. Získané výsledky budou ověřeny dalšími metodami.
Expression of p63 is essential for the formation of epidermis and other stratifying epithelia. Moreover p63 is highly expressed in several epithelial cancers and is involved in tumourigenesis and controlling chemo-sensitivity. The identification of p63 interacting partners is essential for understanding the complex network of gene regulation managing epithelial development and could also help to reveal signalling pathways participating in UV-damage response in human skin. We used a proteomic approach to identify proteins that interact with ∆Np63. Proteins were isolated by immunoprecipitation with ∆Np63 specific antibody and analysed by mass spectrometry. We identified 23 proteins as potential ∆Np63 binding partners that were not present in negative control samples. These results will be evaluated using other methods.
- Klíčová slova
- protein-proteinové interakce, p63,
- MeSH
- DNA vazebné proteiny MeSH
- hmotnostní spektrometrie * metody statistika a číselné údaje MeSH
- imunoprecipitace * metody MeSH
- lidé MeSH
- mapování interakce mezi proteiny metody MeSH
- nádorové buněčné linie MeSH
- nádorové supresorové proteiny analýza chemie MeSH
- protein - isoformy MeSH
- proteomika metody MeSH
- protilátky analýza chemie MeSH
- techniky in vitro MeSH
- trans-aktivátory chemie MeSH
- transkripční faktory * analýza chemie MeSH
- výzkum MeSH
- Check Tag
- lidé MeSH
- Publikační typ
- práce podpořená grantem MeSH
Rapid and reliable detection, identification, and typing of bacterial species are necessary in response to natural or terrorist-caused outbreaks of infectious diseases and play crucial roles in diagnosis and efficient treatment. We report here two proteomic approaches with a high potential in the detection and identification of Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever. The first of them starts with the acetonitrile (ACN) and trichloroacetic acid extractions of inactivated C. burnetii cells followed by the detection of extracted molecules and ions derived from the inactivated cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. In the second approach, identification of the proteins extracted by ACN is accomplished after enzymatic digestion by electrospray tandem mass spectrometry coupled to a nanoscale ultraperformance liquid chromatography (LC-MS/MS). In order to observe morphological differences on the surface structures upon extraction, the inactivated and treated cells of the bacterium were examined by electron microscopy. The LC-MS/MS approach has allowed identification of 20 proteins in the ACN extracts of C. burnetii strain RSA 493 that were observed in more than 3 out of 10 experiments.
- MeSH
- bakteriální proteiny MeSH
- chromatografie kapalinová MeSH
- Coxiella burnetii chemie izolace a purifikace MeSH
- databáze faktografické MeSH
- elektronová mikroskopie MeSH
- financování organizované MeSH
- spektrometrie hmotnostní - ionizace laserem za účasti matrice MeSH
- tandemová hmotnostní spektrometrie MeSH
- trypsin metabolismus MeSH
